作為一種惡性程度非常高的腫瘤，肝癌在全世界範圍內的發病率和死亡率都位居前列。
我國國家癌症中心最新數據顯示，肝癌導致的死亡排名第二位，是我國人民極大的健康負擔[1]。其中， 肝細胞癌（HCC）是肝癌的主要亞型，占據原發性肝癌的75%-85%。 針對HCC治療策略的開發和改進一直是迫切的臨床需求。
眾所周知，針對PD-1和CTLA-4的免疫檢查點抑制劑（ICB）已被廣泛用於癌症治療，對多種晚期癌症有療效。
ICB單藥的臨床數據顯示， 納武利尤單抗[2]和帕博利珠單抗[3]分別在晚期HCC患者治療中達到15%和18.3%的客觀緩解率（ORR）。但同時，ICB在約20%的患者中引起了3級或以上的免疫相關不良事件（irAE）。
聯合免疫療法雖然提高了HCC患者的ORR，但irAEs發生率也隨之增加。例如，抗PD-1聯合抗CTLA-4的ORR為31%，3/4級irAEs的發生率為37%[4]；抗PD-L1聯合抗血管內皮生長因子-A（VEGF-A）的ORR為27.3%，3/4級irAEs的發生率為56.5%[5]。
因此，要改善HCC患者的免疫治療結果，就必須先消除ICB的副作用。
近日，由 新加坡國立癌症中心的David Tai和新加坡國立大學的Valerie Chew領銜的團隊，在 Journal of Hepatology 期刊發表重要研究成果 [6]。
通過深度單細胞免疫分析，他們發現 HCC患者的血液樣本中不同的抗原遞呈細胞（APC）和效應記憶T細胞（TEM）亞型，可作為區分ICB應答和副作用的生物標誌物。而通過控制僅影響ICB副作用產生的免疫通路，他們 在小鼠模型中證實，TNFR2抑制可以在保證ICB治療效果的同時消除免疫治療的副作用。
機制示意圖
研究人員首先收集了在新加坡接受抗PD-1治療的HCC患者（以下簡稱SG組）治療前和治療中的血液樣本，通過質譜流式細胞術（CyTOF）和單細胞測序研究了ICB應答和irAEs的發生機制以及生物標誌物。
接下來他們進行了多輪驗證，包括收集來自韓國的HCC患者樣本（以下簡稱KR組）作為獨立驗證組，用流式細胞術驗證他們從SG組分析中發現的生物標誌物，對SG組治療前和治療後1周的腫瘤活檢樣本進行批量測序分析，最後使用小鼠HCC模型進行治療驗證。
研究流程
研究者們對所有患者（SG+KR）進行了兩種分組。
根據ICB治療結果，患者被分為有反應者 （Res，即部分緩解[PR]或疾病穩定[SD]≥6個月的患者）和無反應者 （Non-Res，即6個月內有疾病進展的患者）。6個月的時間點是根據Checkmate040研究判定，其結果顯示接受納武利尤單抗治療的HCC患者中，SD≥6個月的患者占比37%[7]。
根據是否有過irAEs副作用發生，患者被分為不良反應組 （Tox，即經歷過2級[G2]或以上irAE的患者），和無不良反應組 （non-Tox，即經歷過G1或無irAE）。值得注意的是，G2 irAE是考慮干預或中斷ICB的指標[8]。
為了找到可以在治療早期預測ICB應答或篩查irAEs高風險患者的生物標誌物，研究者們選取了SG組中治療前和治療早期（<6周）的樣本（n=21)。
通過分析6個Res與六個Non-Res樣本的CyTOF結果，研究者們發現了三個在Res組中富集的T細胞簇： FoxP3 + CD4 + T細胞（C33），FoxP3 + CTLA4 + CD4 + 調節性T細胞（Treg）（C3），以及CD8 + CD45RO + CCR7 - CXCR3 + TEM（C76） 。
此外，他們還發現了兩個不同的CD11c + 髓細胞簇，在Res組富含的HLADR hi CD86 + APC簇（C4），和在Non-Res組富含的CD14 + HLADR lo/- ，疑似髓源性抑制細胞簇（MDSCs）（C37）。
ICB Res和Non-Res患者的血液中有不同免疫細胞亞型
接下來，研究者們用流式細胞術對SG和KR組樣本進行了驗證， 對ICB有較好反應的Res組患者血液中普遍有更多Treg，APC，和CXCR3 + CD8 + TEM細胞 。
此外，多變量分析顯示，這些生物標誌物與Res組更好的無進展生存期（PFS）顯著相關。其中 CXCR3 + CD8 + TEM和APC的富集是PFS的獨立預測因子 。
更重要的是，irAEs分組後的分析顯示，CXCR3 + CD8 + TEM和APC仍然在SG和KR兩組的Res患者中顯著富集，尤其是在Non-Tox患者中。這些數據表明， 外周血CXCR3 + CD8 + TEM和APC是HCC ICB治療預後的獨立預測因子 。
與患者ICB治療預後相關的免疫細胞
接下來，研究者們分析了在Tox患者irAEs發生期間或±兩周內採集的血液樣本，並與在相同時間點採集的Non-Tox患者樣本進行了對比。
結果顯示，Tox組的血樣中富含兩個CXCR3 + CD38 + CD16 + CD56 + NK細胞簇（C89，C99），而Non-Tox患者血樣則富含三個CD8 + T細胞簇，兩種TEM（CD45RO + CCR7 - ；C66，C76）和粘膜相關不變T（MAIT）細胞（V7.2 + CD161 + CD56 + CD8 + ，C96），以及一個髓細胞簇（CD11c + CD14 + HLADR + ，C27）。流式細胞術的驗證結果也顯示出相同的趨勢。
有趣的是，前文所提到的在Res組中發現的CXCR3 + CD8 + TEM（C76）同樣在Non-Tox組中富集。在不考慮ICB應答的情況下， 以上五種免疫亞群（NK，CD8 T，TEM，MAIT，APC）代表了與irAEs相關的生物標誌物。
與ICB副作用相關的外周血免疫細胞
為了更深入地了解上述免疫亞群，研究者們對10個外周血樣本進行了單細胞測序，其中包括9個治療中期樣本 （6個Res和3個Non-Res；5個Tox和4個Non-Tox）和一個治療前樣本 （Res/Tox）。
外周血細胞的單細胞測序分析
其中，Treg （CD3D + CD4 + FOXP3 + CTLA4 + IL2RA + ） 簇，和表達ITGAX（CD11c），HLA-DPA1，THBD（CD141）和CLEC9A的常規I型樹突狀細胞（cDC1）APC簇，在Res中顯著富集。
兩個表達CD14和ITGAX（CD11c）的髓細胞簇，CD14-1和CD14-3，則與Non-Tox相關。研究者們還發現， 這些CD14+簇高表達KLF4和CLEC7A，這是巨噬細胞向免疫抑制性極化的標誌[9, 10]。
與ICB應答和irAEs相關的免疫細胞亞群及其基因表達
為了破譯ICB應答和irAE這兩個不同臨床指標背後的免疫機制，研究者們們將目光轉向了與這兩種事件都相關的CD11c + APC。Res患者富集的cDC1簇表達了高水平的HLA相關基因，表明這些細胞具有優秀的的抗原呈遞能力。
CD11c+ APC的基因集富集分析（GSEA）也驗證了這些細胞的功能性，這些細胞的轉錄組富集了包括抗原加工和MHC II類呈遞，T細胞共刺激，干擾素-γ信號傳導等重要的免疫啟動相關基因集。
與Non-Tox相關的其他兩個髓細胞簇（CD14-1和CD14-3）的對比顯示，CD14-1比CD14-3表達了更高水平的抗原呈遞HLA相關基因，而CD14-3則表達了更高水平的免疫抑制性細胞受體STAB1（Clever-1）GSEA分析也顯示， 相對於CD14-1，與Non-Tox更顯著相關的CD14-3減少了抗原呈遞和炎症特徵的基因集，因此更具備免疫抑制性表型。
與Non-Tox相關的髓細胞基因集
研究者們也對前文中與ICB應答和irAEs相關的重要CD8 + T細胞簇（CXCR3 + TEM）進行了單細胞測序分析。
他們發現，與 所有其他T細胞相比，CXCR3 + TEM上調了包括抗原呈遞，HLA（s），炎症，顆粒酶，和細胞增殖的多個基因 ，例如MKI67。相反，CCR7，IL7R和LEF1等幼稚T細胞基因在CXCR3 + TEM中表達下調，表明這些T細胞有效應記憶表型。
GSEA分析也不出所料的呈現出包括炎症反應，細胞溶解，抗原加工以及通過MHC II類呈遞等基因集在CXCR3 + TEM中富集。
這些結果都顯示， 與其他T細胞相比，CXCR3 + CD8 + TEM呈現出強炎症和細胞溶解力表型 。
與Res和Non-Tox相關的CXCR3 + TEM細胞基因表達和基因集富集
他們發現， 可促進炎症和腫瘤發生的三種受體，淋巴毒素α（LTA）受體，腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF1A，1B），和淋巴毒素β受體（LTBR）[12]均在Res和Tox組的CXCR3 + CD8 + TEM細胞樣本中富集 。也就是說，這些細胞擅長與其他細胞形成促炎相互作用，從而導致ICB應答和irAEs。
CXCR3 + CD8 + TEM的細胞串擾分析
此外，研究者們還觀察到CXCR3 + CD8 + TEM和髓細胞群之間存在明顯的TNF相互作用。Res患者的TEM和APC之間主要進行的是TNF-TNFRSF1B（TNFR2）信號傳導，Non-Tox患者則是TNF-TNFRSF1A（TNFR1）信號傳導。TNF與TNFR1和TNFR2的相互作用在巨噬細胞活化和炎症中有著重要角色[13]。
研究者們用流式細胞術測定了TNF，TNFR1，和TNFR2的蛋白質表達。他們發現， Res組的CXCR3 + CD8 + TEM細胞比Non-Res組表達了更高的TNF 。
在髓細胞的對比中，Non-Tox組的CD14 + 單核細胞和CD14 - CD11c + HLA - DR + 樹突狀細胞（DC）比Tox組增加了TNFR1表達。而對比Res和Non-Res組時，研究者們發現單核細胞和DC上的TNFR2表達沒有顯著差異。
也就是說，ICB應答（Res）中TNF信號作用的增加主要是由TNF上調驅動的，而在沒有irAEs（Non-Tox）的患者中，主要是由於TNFR1表達增加。這表明，我們 可以利用不同的TNF信號通路來解耦ICB應答和irAEs的產生，在保留治療效果的同時抑制副作用的發生。
為了驗證這個假設，研究者們用小鼠模型進行了抗PD-1和/或抗TNFR1或抗TNFR2的治療試驗。
小鼠藥物試驗流程
經過四輪治療， 腫瘤結節在所有聯合治療組的小鼠中都顯著減少，而接受抗PD-1+抗TNFR2聯合治療的小鼠腫瘤負荷為零。
研究者們還觀察到， 抗PD-1+抗TNFR1治療組小鼠的肝臟/體重比顯著增高，而小鼠沒有體重或腫瘤負荷上的明顯變化，這側面說明了這組小鼠表現出了肝臟肥大和炎性副作用。這項結果也證實了研究者們之前在Non-Tox患者中觀察到的TNFR1增加有防止irAEs的保護作用。
令人驚喜的是，抗PD-1+抗TNFR2治療組的小鼠副作用水平和對照組一致，並成功清除了腫瘤，這些結果給研究者們的假設提供了有力的支持。
研究者們認為， TNFR2抑制之所以能在保護ICB作用的情況下降低副作用炎性反應，是因為TNFR2優先表達於高免疫抑制型Treg細胞上。為了驗證這個假設，研究者們從患者外周血，非腫瘤肝臟，和HCC樣本中分選了Treg和腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）進行對比。
他們發現，與TIL中的其他細胞相比，Treg的TNFRSF1B（TNFR2）表達顯著高於TNFRSF1A（TNFR1）。與來自外周血的或非腫瘤肝臟組織的Treg相比，TIL-Treg的TNFRSF1B表達也顯著增高。這些發現證明， TNFR2特異表達於HCC TIL中的Treg細胞，抑制後可以增強抗腫瘤反應，並不會增強全身副作用。
小鼠藥物試驗結果
此外，研究者們還在所有抗PD-1治療組（單藥或聯合治療）的小鼠腫瘤中觀察到了CXCR3 + CD8 + T細胞和CD11c + MHCII + XCR1 + cDC1細胞數量的增加。前文提到，這些免疫亞型是HCC患者外周血中與ICB應答相關的生物標誌物，相似的免疫亞型或是小鼠腫瘤浸潤中起到關鍵抗癌作用的細胞。
小鼠腫瘤浸潤免疫細胞
總的來說，這項研究成果揭示了HCC患者外周血TEM和APC與ICB治療應答和irAEs都有重要關係， 免疫應答和irAEs反應是由TEM和APC之間不同的TNF信號通路所促成的。
因此，通過阻斷造成irAEs的TNFR2信號傳導可實現ICB副作用的消除，這對未來HCC患者的ICB療效早期檢測和聯合免疫療法的改進都有重要的意義。
參考文獻
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13. Wajant H, Siegmund D. TNFR1 and TNFR2 in the Control of the Life and Death Balance of Macrophages. Front Cell Dev Biol. 2019;7:91. Published 2019 May 29. doi:10.3389/fcell.2019.00091