免疫檢查點抑制劑（ICI）給50%以上的非小細胞肺癌（NSCLC）患者帶來了生存獲益[1]；然而還是有很多患者無法從治療中獲得益處，而且接受免疫治療的部分患者還會出現嚴重的不良反應。
腫瘤突變負荷（TMB）是一種有前景的生物標誌物，它是腫瘤基因組中每個編碼區的體細胞突變總數。已有研究發現 高TMB腫瘤可能會產生更多新抗原，進而引發更強地抗腫瘤免疫反應[2,3]。
早在2020年，FDA就批准了FoundationOne CDx（F1CDx）用於不可切除或轉移性高TMB實體瘤患者進行基於組織腫瘤突變負荷（tTMB）的評估，以10mut/Mb為臨界值來決定在哪些患者中使用帕博利珠單抗[4]。
但是，tTMB評估需要對患者進行有創操作，存在固有併發症的風險。此外，活檢取材少，可能會導致DNA量不足而影響分析結果[5]。而 基於血液腫瘤突變負荷（bTMB）不僅可以彌補tTMB檢測的缺陷，還可以避免原發性和轉移性病變之間的空間腫瘤內異質性。
近日，由 羅氏Daniel Klass領銜的研究團隊，在 Journal for ImmunoTherapy of Cancer 上發表重要研究成果[6]。 他們 基於bTMB，設計了肺TMB面板，用於檢測I期至IV期NSCLC患者。
結果顯示： 當以tTMB臨界值16mut/Mb為判定標準時，1.1Mb的肺TMB面板具有高度準確的TMB檢測響應性，陽性預測值（PPV）為95%，相當於bTMB的42mut/Mb；但bTMB的陽性符合率（PPA）相對較低，為32%。但在IV期NSCLC患者中，且cfDNA輸入量至少為20ng時，bTMB的PPA可以提高到63%，並且可以將檢測面板最小化到577kb。
這一結果有望使bTMB成為NSCLC患者免疫治療的預測性生物標誌物。
論文首頁截圖
首先，研究人員利用已有~2.2M的tTMB檢測面板對183份腫瘤組織樣本進行分析，結果顯示tTMB檢測面板的TMB中位值高於TCGA資料庫中肺癌、腺癌和鱗狀細胞癌樣本的全外顯子測序（WES）分析值（13.9 vs 7.6）。此外，in-silico模擬比較顯示tTMB面板與FDA批准的F1CDx面板具有良好的相關性（R2=0.99）。
接下來，Klass團隊利用CAPP-Seq面板設計算法，儘可能設計一個較小的、且突變最大化的、用於肺TMB檢測的血漿面板，以使每個樣本的檢測成本最小化。研究人員以覆蓋關鍵基因的約300Kb為核心，每次添加約50Kb， 最終形成一個約1.1Mb的肺TMB面板，覆蓋965個基因的外顯子區域。
緊接著，研究人員用肺TMB面板對178份血漿樣本進行分析，結果顯示測序深度與cfDNA輸入量密切相關， 當cfDNA輸入量大於30ng，測序深度大於3000，表明該面板檢測突變高度準確。
為了評估肺TMB面板的臨床效果，研究人員利用Rizvi等人發表的NSCLC隊列WES數據進行了in-silico模擬評估[7]。結果顯示， WES臨界值（10 mut/Mb）轉換後相當於肺TMB面板的19.3 mut/Mb。
此外， 在持久臨床獲益（DCB）和無持久臨床獲益（NDB）患者中，與WES相比，肺TMB面板對兩類患者的分離效果更強（p=0.002），在對無進展生存（PFS）率的改善預測分析中，同樣地，肺TMB面板分離效果更強（p=0.0039, HR=4.023）。
肺TMB面板可以將DCB和NDB患者分開，同樣可以將不同PFS率的患者分開
為了比較腫瘤組織TMB面板與肺TMB面板的TMB值，研究人員利用肺TMB面板重新捕獲組織樣本，並確定兩個面板間TMB值的相關方程，分析顯示 組織面板中16mut/Mb對應於肺TMB面板中42mut/Mb。
研究人員利用tTMB臨界值16 mut/Mb，進一步評價血漿和腫瘤組織間TMB分類（TMB-H和TMB-L）的一致性，結果顯示 肺TMB面板檢測TMB-H的PPV同樣很高（91%-100%），表明血漿檢測準確性很好。但是肺TMB面板檢測TMB-H的PPA較低（24%-32%），表明敏感性較低。
考慮到血漿面板PPA較低，研究人員認為可能與早期或脫落率較低腫瘤所提取的cfDNA量少相關。分析結果顯示，cfDNA輸入量的增加，組織和血漿TMB之間的相關性得到明顯改善。通過分析， 研究人員建議要至少輸入20ng cfDNA，才能準確、可重複地評估bTMB[8]。
cfDNA輸入量對bTMB評估的影響
接著，研究人員又分析了腫瘤負荷對bTMB評估的影響。結果顯示， 腫瘤負荷大於0.1%等位基因頻率的樣本，組織和血漿間TMB值具有較好的相關性。
由於腫瘤負荷與腫瘤分期相關，研究人員進一步分析發現，I、II、III、IV期疾病患者的樣本，其bTMB的PPA從0%逐漸上升到11%、35%、54%，且在IV期NSCLC患者樣本中，組織和血漿間TMB值相關性最強。
然後，研究人員將cfDNA輸入量、腫瘤負荷和腫瘤分期三者相結合進行分析，發現 當僅限於來自IV期、cfDNA>20ng患者的樣本，在組織TMB臨界值為16mut/Mb時，血漿高TMB患者的PPV和PPA分別為100%和63%。
cfDNA輸入量、腫瘤負荷和腫瘤分期三者相結合的分析
最後，為最大限度地減小肺TMB測序面板，研究人員對設計過程中面板子集進行了研究，結果發現， 與1.1 Mb肺TMB面板相比，至少約577 kb的面板具有相似的檢測性能和臨床相關性。
總的來說，本研究設計開發的bTMB檢測面板，成本效益高、檢測精度高，且明顯小於以前設定的最小值（1Mb），因此bTMB有望成為判斷NSCLC患者能否接受ICI治療的預測性生物標誌物。
參考文獻：
[2] Rooney MS, Shukla SA, Wu CJ, Getz G, Hacohen N. Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity. Cell. 2015;160(1-2):48-61. doi:10.1016/j.cell.2014.12.033
[4] Fda approves pembrolizumab for adults and children with TMBH solid tumors. Available: https://www.fda.gov/drugs/drug-approvals-and-databases/fda-approves-pembrolizumab-adults-and-children-tmb-h-solid-tumors2020 [Accessed 13 Dec 2021].
[7] Rizvi NA, Hellmann MD, Snyder A, et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 2015;348(6230):124-128. doi:10.1126/science.aaa1348