本文報道了一例基於ddPCR平台檢測到BRAF V600E變異的肛門黑色素瘤。BRAF V600E是黑色素瘤中常見的可靶向基因變異。出乎意料的是，BRAF V600E突變型與野生型拷貝數的比率很低（0.3%），而組織切片上的腫瘤細胞占比為＞90%。通過進一步檢查，BRAF V600E免疫組化檢測（IHC）證實了一個非常小的BRAF V600E陽性細胞亞群，二代測序（NGS）panel檢測結果顯示了致病性KIT變異p.L576P，變異丰度為63%。研究者最初假設黑色素瘤的主要驅動因素是KIT變異，而一個小亞克隆是由ddPCR檢測到的BRAF V600E驅動（NGS未檢測到，其檢測限為5%）。為了確定這兩個克隆之間是否有形態學差異，研究者對組織學進行了仔細複查，結果顯示BRAF V600E陽性細胞的形態學不同，包括淡色細胞質、核凹槽和浸潤嗜酸性粒細胞。IHC檢測BRAF V600E陽性細胞顯示CD1a、Langerin和S100共表達，診斷為朗格漢斯細胞組織細胞增生症（LCH）。這一診斷出乎意料，如果沒有高靈敏度的分子檢測，會被漏診。而這一診斷對患者有臨床意義。這個案例報道提出了關於黑色素瘤和LCH之間的生物學相關問題，此外，強調了在分子數據解讀中整合定量信息的重要性。
病例
患者男，74歲，因直腸疼痛就診。檢查發現肛門腫塊，組織學和免疫組化檢查診斷為黑色素瘤（由於病變累及肛門兩側，故不確定是原發性皮膚病變還是粘膜病變）。PET/CT掃描未發現局部或衛星病灶，也未發現遠處或淋巴結轉移（臨床分期：N0M0）。患者接受了切除術，隨後進行了分子檢測，以指導治療和預後。然後在梅奧診所進行了基於微滴式數字PCR（ddPCR）平台的BRAF V600E/K檢測。檢測前，檢查組織切片並評估腫瘤細胞占比為＞90%。對載玻片上的整個腫瘤組織進行檢測，檢測結果顯示為BRAF V600E變異，是黑色素瘤最常見的可靶向變異。值得注意的是，突變型與野生型拷貝數的比率低於腫瘤細胞占比（0.3% vs ＞90%；圖1）。這一差異促使研究者進一步調查其原因。
圖1
研究者首先進行了BRAF V600E免疫組化檢測（IHC），以證實該變異的存在。結果顯示，BRAF V600E IHC只染色了一小部分細胞（圖2），這證實了ddPCR結果。這一發現最初被認為是在黑色素瘤中罕見地存在攜帶BRAF V600E的亞克隆，而大多數剩餘的腫瘤細胞（BRAF V600E陰性）具有不同的驅動變異。為了驗證這一假設，研究者隨後進行了黑色素瘤二代測序（NGS）panel（BRAF、GNAQ、GNA11、KIT、NRAS）檢測，以評估是否存在其他驅動基因變異。結果顯示為KIT變異，c.1727T＞C（外顯子11），p.L576P，變異丰度為63.2%，與腫瘤細胞占比非常匹配。該黑色素瘤NGS panel的檢測下限為5%，因此未檢測到低頻BRAF V600E變異。此時，研究者懷疑黑色素瘤的主要部分是由KIT變異驅動的，而一個小亞克隆是由BRAF變異驅動。從臨床角度來看，亞克隆BRAF V600E的檢測在治療管理方面具有不確定的意義，因為理想情況下，靶向變異應該是克隆而不是亞克隆。
圖2
最後，研究者想了解攜帶BRAF V600E的亞克隆在形態學上是否與由KIT L576P驅動的主體黑色素瘤部分不同。研究者仔細回顧了腫瘤的組織學，發現BRAF V600E陽性細胞實際上更小，其特徵是細胞核有凹槽/摺疊，核仁不明顯，細胞質豐富，呈淡色嗜酸性（圖2）。此外，這些細胞內混合有增多的嗜酸性粒細胞。所有這些形態學特徵均提示為朗格漢斯細胞組織細胞增生症（LCH）。隨後進行了其他免疫組化檢測，結果顯示BRAF V600E陽性細胞也強表達CD1a、Langerin和S100，而Melan A、CD163、c-kit陰性（圖3）。值得注意的是，黑色素瘤細胞的細胞核呈多形性，具有明顯的核仁和豐富的嗜酸性細胞質（圖2），且表達Melan A、c-kit和弱S100（圖3）。這一IHC模式支持局灶性LCH合併黑色素瘤的診斷。
圖3
研究者想對LCH病灶和黑色素瘤成分進行單獨的顯微切割，從而進行單獨的分子檢測，以更好地表征每個實體的基因組圖譜，以及分析共享的變異和通路激活。然而，LCH病灶太小且界限不清，無法進行上述分析。需要進一步的研究來調查同時發生的LCH和黑色素瘤之間可能存在的關係，無論是否存在共同的BRAF致病性變異。
術後給予患者局部放療。腫瘤治療團隊計劃用抗PD-1輔助免疫療法對患者進行為期1年的治療。術後約8個月PET/CT複查提示左側腹股溝淋巴結腫大，懷疑轉移。在另一家醫院進行了淋巴結切除術，並證實許多淋巴結僅為轉移性黑色素瘤陽性，而可獲得的臨床記錄中沒有提到LCH的形態學證據。當然，其他機構未採用ddPCR等敏感方法進行BRAF V600E檢測，以排除低水平LCH受累。臨床團隊目前正在考慮用於治療黑色素瘤的其他免疫療法，並且正在監測患者是否存在LCH及其程度。
討論
高靈敏度通常是分子診斷工具的理想特徵，可以實現準確的診斷和高陰性預測值。然而，將定量結果與其他臨床和實驗室檢查結果相結合對於準確解讀檢測結果至關重要。本文報道了一例基於ddPCR平台檢測到BRAF V600E變異的肛門黑色素瘤。令人驚訝的是，與評估的腫瘤細胞占比（＞90%）相比，BRAF V600E變異是低頻信號（0.3%，突變/野生型拷貝數比）。這一差異促使研究者對組織學進行了仔細審查，這反過來又有助於識別意外的共存疾病過程。該案例反映了在分子檢測中，整合定量信息對於數據解讀是非常重要的。基因致病性變異的變異丰度可揭示腫瘤的克隆結構，並有助於確認組織學或臨床上可能不明顯的克隆異質性。
朗格漢斯細胞組織細胞增生症是一種具有不同臨床表現和預後的異質性疾病。常見的基因變異涉及MAPK/ERK通路，其中BRAF V600E發生於約50%的病例。LCH與惡性腫瘤（包括皮膚黑色素瘤）共存的病例之前已經報道過（表1），其中一個病例的結果與本病例相似，皮膚黑色素瘤與一個非常小的鄰近/混合性LCH病灶相關。值得注意的是，此前也曾報道過幾例與兒童非惡性黑素細胞病變相關的LCH病例（表1）。這將是第一個描述LCH與粘膜黑色素瘤相關的病例，LCH的數量很少，並且客觀上很難通過組織學評估來檢測。能夠檢測LCH並解讀明顯不一致的分子發現對患者具有重要意義，特別是對於BRAF V600E變異的解讀。
表1
成人LCH可能是局灶性的或多系統受累，其治療及預後取決於所涉及的器官系統。例如，成人非肺性、單灶LCH往往預後良好，5年總生存率為94%。然而，復發也有可能發生在不同的器官系統。因此，臨床隨訪極為重要。值得注意的是，研究提示，在一線和復發治療中，BRAF V600E突變的LCH可使用BRAF抑制劑進行有效治療。對於臨床醫生來說，了解LCH共存的惡性腫瘤非常重要，因為其可能影響臨床治療和疾病監測。總體而言，當LCH合併惡性腫瘤時，治療LCH的決策可能取決於不同因素，包括LCH亞型（單灶、單系統肺部或多灶和多系統）、是否存在可靶向的BRAF變異、合併惡性腫瘤的類型和程度、以及患者的基線臨床表現。從治療黑色素瘤的角度來看，了解是LCH而不是轉移性黑色素瘤攜帶BRAF V600E，也是至關重要的。最後，「真正」驅動基因變異KIT L576P的檢測支持該肛門黑色素瘤起源於粘膜（而非皮膚），有助於更好地定義該病變並進一步優化治療。
本病例強調了仔細分析並將組織學、分子和臨床結果相關聯的重要性。ddPCR等高靈敏平台是檢測潛在可靶向致病性變異的重要工具，並且是患者個性化治療的基礎。從實驗室的角度來看，除了評估是否存在致病性變異之外，量化該變異也很重要，以便更好地表征和理解所檢測疾病過程的生物學特徵。從臨床角度來看，關注變異及其量化/頻率將有助於專注正確的靶點，優化患者管理，因為服用不需要的藥物可能與不服用有效藥物一樣有害。
參考文獻：
Buglioni A, Guo R, Rumilla KM, Edgar MA, Markovic SN, Zheng G. An Unexpected Diagnosis Uncovered by Quantitative Molecular Findings: A Case Report. J Natl Compr Canc Netw. 2023;21(8):787-791. doi:10.6004/jnccn.2023.7014