胃癌的發病率和死亡率在全球範圍內均位居前列，我國是胃癌大國，占全球胃癌新發病例的43.9%及死亡病例的48.6%[1]。在過去的幾十年里，胃癌的治療取得了長足的進步，但是死亡率仍然很高。因此探索胃癌發生的分子機制，尋找有效的治療靶點是改善預後的關鍵。
N6-腺苷酸甲基化（m6A）是常見的RNA轉錄後修飾，主要用於維持mRNA的穩定性。發生m6A修飾的mRNA想要行使特定的生物學功能，需要甲基化閱讀蛋白。
含YTH結構域的家族蛋白1（YTHDF1）是一種重要的m6A閱讀蛋白。最近的研究表明，YTHDF1可以通過捲曲蛋白7（FZD7）和泛素特異性肽酶14（USP14）促進胃癌的發生[2]。那麼，YTHDF1在胃腫瘤微環境中的起著怎樣的作用呢？
近日， 來自香港中文大學的於君教授及其團隊在《癌症免疫治療雜誌》上發表重要研究成果，他們發現， YTHDF1在胃癌中過表達，並通過誘導腫瘤細胞增殖和抑制樹突狀細胞介導的抗腫瘤免疫反應來促進胃癌的進展。此外，YTHDF1缺失可促進腫瘤細胞中干擾素受體1(IFNGR1)和JAK-STAT1信號通路的過表達，進而增加抗腫瘤免疫的敏感性。未來，YTHDF1有望成為胃癌免疫治療的新靶點[3]。
論文首頁截圖
接下來我們一起看看這項研究是如何開展的。
首先，研究人員收集了2015年到2018年在威爾斯親王醫院確診的胃癌患者組織樣本101例組成隊列1，用於檢測YTHDF1 mRNA的表達情況，同時收集1998年到2006年確診的胃癌患者組織樣本278例組成隊列2，用於檢測YTHDF1蛋白表達水平。
隨後，研究團隊還從TCGA資料庫中選取了胃癌患者的腫瘤組織樣本和癌旁正常組織樣本（其中未配對組：癌旁正常組織32例，腫瘤組織375例；配對組：同一患者的腫瘤組織和癌旁正常組織各27例），目的是為了分析胃癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織中m6A相關基因的表達情況。
結果顯示，無論是在配對組還是在未配對組的腫瘤組織中，均觀察到YTHDF1表達上調現象。同時，研究人員也在威爾斯親王醫院收集的隊列1和隊列2的胃癌患者組織樣本中觀察到YTHDF1 mRNA水平和YTHDF1蛋白水平在胃癌患者的腫瘤組織中均出現過表達。
那麼，YTHDF1的表達情況與胃癌患者的預後是否相關呢？
在隊列1中，K-M曲線顯示， YTHDF1 高mRNA表達與胃癌患者的低生存率顯著相關（P=0.0164），多變量Cox回歸分析中， YTHDF1 高mRNA表達是胃癌患者的獨立不良預後因素（P=0.002）。在隊列2中觀察到，YTHDF1蛋白過表達與胃癌患者的低生存率相關（P=0.039）。
YTHDF1在胃癌中過度表達，其表達與胃癌患者的低生存率相關。
A：YTHDF1 mRNA水平表達情況及其與胃癌患者生存率的關係；B：TCGA隊列中YTHDF1 mRNA水平的表達情況；C：YTHDF1蛋白表達情況與胃癌患者生存率的關係。
為了進一步探索YTHDF1在胃癌中的生物功能，研究人員檢測了12種人胃癌細胞株中YTHDF1蛋白的表達情況，發現YTHDF1蛋白在三種人胃癌細胞系AGS、BGC823、MKN74中表達相對較高。於是研究人員打算選取這三個細胞系進行YTHDF1基因敲降，結果發現，YTHDF1的敲降顯著抑制了AGS、BGC823、MKN74細胞的增殖。同時，研究人員對小鼠胃癌細胞系YTN16進行了YTHDF1基因敲除，結果也觀察到類似的現象。隨後的功能試驗顯示， YTHDF1敲降/敲除後可顯著抑制人和小鼠胃癌細胞的增殖和集落形成能力。
YTHDF1敲降可抑制胃癌細胞株增殖
A：western blot證實細胞株中YTHDF1基因敲降效果
B：YTHDF1基因敲降後對胃癌細胞活力的影響
C：YTHDF1基因敲降後對胃癌細胞集落形成能力的影響
以上體外實驗結果表明，YTHDF1有明顯的促癌作用。為了探索YTHDF1在體內是否也有同樣的促癌作用，研究人員分別將轉染空白質粒的MKN74細胞（MKN74-shNC）和敲降YTHDF1表達的兩個穩轉細胞系MKN74-shYTHDF1-1和MKN74-shYTHDF1-2分別接種到小鼠皮下。
結果顯示， 與接種MKN74-shNC的小鼠相比，接種MKN74-shYTHDF1-1和MKN74-shYTHDF1-2的小鼠，皮下腫瘤的大小和重量均明顯減小。這一結論在接種轉染空白質粒的YTN16-sgNC細胞和YTHDF1基因敲除（YTN16-sgYTHDF1-1和YTN16-sgYTHDF1-2）細胞的小鼠中得到了進一步驗證。
小鼠皮下成瘤實驗
D：NSG小鼠接種MKN74細胞和YTHDF1低表達細胞對皮下成瘤的影響
E：NSG小鼠接種YTN16細胞和YTHDF1低表達細胞對皮下成瘤的影響
體內外實驗均表明，YTHDF1可明顯促進胃癌細胞的增殖，為了明確其發生的相關分子機制，研究人員進一步對YTN16-sgNC細胞和YTHDF1基因敲除細胞進行了RNA測序。
分析顯示，在YTHDF1基因敲除細胞中，有575個基因表達上調，866個基因表達下調。基因富集分析揭示了YTHDF1基因敲除細胞中免疫調節途徑基因的缺失，包括CTLA-4檢查點通路和CD209 DC通路。同時，研究人員使用KEGG資料庫進行基因富集分析時發現，在YTHDF1基因敲除細胞中JAK-STAT信號通路基因表達上調，T細胞受體信號通路基因表達下調。這些結果提示，YTHDF1可能在體內發揮免疫調節作用。
接下來，為了探索YTHDF1的促癌作用是否依賴於免疫系統，研究團隊使用了具有免疫活性的同源小鼠模型C57BL/6小鼠，在其皮下分別接種YTN16-sgNC細胞和YTHDF1基因敲除細胞。在整個持續6周的實驗過程中， 接種YTN16-sgNC細胞的小鼠腫瘤持續增長，接種YTHDF1基因敲除細胞的小鼠在接種1周後皮下雖均有腫瘤長出，但接種YTN16-sgYTHDF1-1的小鼠皮下腫瘤在2周後開始逐漸縮小。這說明YTHDF1的促癌作用至少部分依賴於功能正常的免疫系統。
2周後，腫瘤體積變化情況
既然在免疫系統正常的情況下，YTHDF1基因敲除可加快小鼠皮下腫瘤的消除，研究人員猜想腫瘤中的YTHDF1是否能在體內調節抗腫瘤免疫呢？於是，他們在C57BL/6小鼠身上分別接種YTN16-sgNC細胞和YTHDF1基因敲除細胞，並在2周後收集腫瘤，通過流式細胞術檢測腫瘤微環境中的免疫細胞浸潤情況。
結果顯示， 與接種YTN16-sgNC細胞相比，接種YTHDF1基因敲除細胞的小鼠腫瘤大小和重量都有明顯的減少。流式細胞儀分析顯示，YTHDF1基因敲除組的腫瘤組織中浸潤性免疫細胞（CD45+細胞）的比例明顯高於YTN16-sgNC組（P<0.05）。
在同源小鼠模型中，YTHDF1缺失可誘導腫瘤消除並增加免疫細胞浸潤
眾所周知，T細胞（CD3+淋巴細胞）是適應性腫瘤免疫的重要組成部分，於是，研究人員進一步分析了C57BL/6小鼠腫瘤組織中T淋巴細胞的浸潤情況。結果顯示，YTHDF1基因敲除組腫瘤組織中，CD3+細胞和CD45+細胞比例顯著高於YTN16-sgNC組，且在浸潤性免疫細胞中，CD4+T細胞和CD8+T細胞數量和占比也均高於YTN16-sgNC組。
由於干擾素γ（IFNγ ）由活化的淋巴細胞分泌[4]，因此，研究人員進一步檢測了腫瘤組織中IFNγ的表達水平。 與YTN16-sgNC組腫瘤組織相比，YTHDF1基因敲除組腫瘤組織中的IFNγ顯著升高。有趣的是，通路富集分析顯示，YTN16細胞YTHDF1敲除後，IFNGR1是JAK-STAT信號通路中的上調最明顯的基因，並且在胃癌細胞株中發現，YTHDF1缺失使IFNGR1、JAK1、JAK2和STAT1蛋白表達上調。以上結果表明，YTHDF1基因敲除使IFNGR1上調進一步激活JAK-STAT1通路，從而增強腫瘤免疫監視。
腫瘤細胞中YTHDF1的缺失激活了適應性抗腫瘤免疫
從上文可知，腫瘤細胞中敲降YTHDF1表達後可增強適應性T細胞抗腫瘤免疫，那麼，YTHDF1表達情況對腫瘤內的免疫抑制細胞有何影響呢？
髓源性抑制細胞（MDSCs）是一種具有免疫抑制能力的腫瘤浸潤性免疫細胞，越來越多的證據表明，MDSCs的高浸潤性與不良預後和治療耐藥有關[5]。於是，研究人員通過流式細胞術檢測了YTN16腫瘤組織中的MDSCs浸潤情況後發現，與YTN16-sgNC組腫瘤組織相比，YTHDF1基因敲除組腫瘤組織和浸潤性免疫細胞中的MDSCs比例更低。
適應性抗腫瘤免疫主要依賴於樹突狀細胞（DC），DC將腫瘤細胞的抗原呈遞給T淋巴細胞，前面結果已證實，腫瘤細胞敲降YTHDF1表達後可促進適應性T淋巴細胞的浸潤。那麼，YTHDF1敲降後是否也會增加DC浸潤呢？
於是研究人員也觀察了C57BL/6小鼠腫瘤組織中DC的浸潤情。結果顯示，YTHDF1基因敲除組腫瘤組織中浸潤性DC的比例明顯高於YTN16-sgNC組，且DC表面組織相容性復合體II類分子（MHCII）表達增高，MHCII表達是DC細胞成熟的基本特徵，而成熟的DC可分泌白細胞介素-12（IL-12）以增強適應性抗腫瘤免疫。隨後，研究發現，YTHDF1基因敲除組腫瘤組織中IL-12明顯高於YTN16-sgNC組。此外，在TCGA隊列中，DC腫瘤浸潤與YTHDF1 mRNA表達呈負相關。
腫瘤細胞中YTHDF1缺失可招募成熟樹突狀細胞
以上這些結果表明， 腫瘤細胞中YTHDF1缺失可誘導成熟DC的募集，從而促進CD4+T細胞和CD8+T細胞的浸潤，並增加細胞毒性細胞因子IL-12的分泌。
研究團隊為了進一步評估腫瘤組織中YTHDF1的表達是否會影響全身抗腫瘤免疫應答，他們在同一小鼠身上接種了YTN16-sgNC細胞和敲降YTHDF1表達的穩轉細胞YTN16-sgYTHDF1-1。隨後根據接種情況不同，研究人員將小鼠分成了3組，分別是YTN16-sgNC組、YTN16-sgYTHDF1-1組和混合組。在YTN16-sgNC和YTN16-sgYTHDF1-1組中，都是將同一細胞分別接種到小鼠的兩側。而在在混合組中，則是將YTN16-sgNC和YTN16-sgYTHDF1-1細胞分別接種到同一小鼠的左側和右側。
結果顯示，接種8周後，YTN16-sgNC組有腫瘤生長，YTN16-sgYTHDF1-1組無腫瘤生長；而混合組小鼠兩側均有腫瘤生長，但右側腫瘤體積明顯小於左側，蛋白印跡實驗證實了sgYTHDF1-1腫瘤保留了YTHDF1蛋白的丟失。這表明，YTN16-sgNC腫瘤可能導致抗腫瘤免疫的系統性抑制，反過來又允許YTN16-sgYTHDF1-1腫瘤存活。
3組小鼠接種後，腫瘤體積變化情況
既然YTHDF1缺失可消除具有免疫活性宿主中的腫瘤，那麼接下來研究人員猜想它是否能觸發持久的全身性抗腫瘤免疫反應，從而阻止未來的腫瘤植入？於是他們將小鼠分為兩組，分別將YTN16-sgNC細胞和YTN16-sgYTHDF1-1細胞接種到小鼠的右背側，接種2周後，切除右背側腫瘤，然後將YTN16-sgNC細胞注射到左側。結果顯示，之前接種YTN16-sgNC細胞組小鼠左側有腫瘤生長，之前接種YTN16-sgYTHDF1-1細胞組未見腫瘤生長。這些結果表明，接種YTN16-sgYTHDF1-1細胞後的小鼠，可充分觸發宿主的抗腫瘤免疫，從而阻止隨後接種表達正常YTHDF1細胞的腫瘤植入。
總的來說，這個研究表明，YTHDF1在胃癌中過表達，並發揮促癌作用；YTHDF1缺失誘導DC細胞募集，並增加MHCII表達和IL-12分泌，進而促進CD4+和CD8 T+細胞的浸潤，增加干擾素γ的分泌；YTHDF1缺失介導了腫瘤細胞中IFNGR1和JAK-STAT1信號通路的過表達，這可能有助於恢復抗腫瘤免疫的敏感性。本研究為胃癌的有效免疫治療提供了一種新策略，YTHDF1有望成為胃癌免疫治療的新靶點。
參考文獻：
1.曹毛毛, 李賀, 孫殿欽, et al. 2000—2019年中國胃癌流行病學趨勢分析. 中華消化外科雜誌 2021;20(1):102-09.
4.Kasahara T, Hooks JJ, Dougherty SF, Oppenheim JJ. Interleukin 2-mediated immune interferon (IFN-gamma) production by human T cells and T cell subsets. J Immunol. 1983;130(4):1784-1789.