在晚期非小細胞肺癌中，分子檢測已在臨床實踐中得到應用，用於發現可治療的分子變異。意外的分子結果可能導致臨床診斷的重新考慮；然而，這種情況尚未得到系統研究。本研究回顧了1007例考慮為非小細胞肺癌的連續患者的NGS檢測結果，以及相應的臨床病史和解剖病理結果。1007例患者中有12例（1.2%）最終診斷為肺外起源的癌症。支持最終診斷的分子證據包括發現紫外線（UV）輻射相關突變（n=6）、基因融合（n=2）和突變（n=4）。綜合診斷包括未分化黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌、基底細胞癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、胰腺癌、肝內膽管癌和滑膜肉瘤。在臨床考慮為非小細胞肺癌的患者中，有一小部分在臨床NGS檢測後最終被診斷為肺外起源的癌症，這不容忽視。臨床、顯微鏡和分子證據的整合可以輔助診斷並指導個體化治療。
研究背景
在晚期非小細胞肺癌臨床實踐中，下一代測序（NGS）技術已得到迅速應用，用於指導患者的靶向治療選擇。臨床實踐指南支持NGS的使用。實驗室正在開發和驗證臨床癌症NGS檢測。美國大多數腫瘤學專家在患者診療過程中使用NGS。
開發了腫瘤NGS panel用於臨床識別可靶向治療的分子變異。傳統上，可靶向治療變異包括致癌基因突變和基因融合，其組成性激活細胞生存通路，是小分子抑制劑的直接靶點。截至2022年，FDA批准的晚期肺癌靶向藥物靶點包括EGFR、KRAS p.G12C、MET外顯子14跳躍、BRAF p.V600E和ERBB2突變，以及ALK、ROS1和RET基因融合。
傳統的解剖病理學將臨床病史、大體病理學、組織病理學和免疫組化納入最終病理診斷。儘管在大多數情況下可以確定起源和細胞譜系，但也存在局限性。3%至5%的腫瘤原發部位無法通過病理學確定，大多數原發灶不明癌患者預後不良。在非小細胞肺癌的診斷中，譜系特異性標記物（TTF1和napsin A）對肺腺癌的敏感性有限，鱗狀細胞癌常用標記物（p63和p40）在不同原發部位的鱗狀細胞癌中表達。在臨床實踐中，免疫組化在肺癌診斷中的應用程度不同。
與針對單個基因的分子檢測相比，NGS檢測覆蓋數百個基因，為臨床診療提供信息，例如識別罕見驅動基因變異和特異性突變。在某些臨床情境中，NGS結果提示的診斷可能與臨床或組織學診斷相矛盾。而NGS結果輔助診斷的能力尚未得到系統評估。
本研究報告了一組考慮為非小細胞肺癌患者的臨床NGS檢測結果。我們將分子結果與臨床和病理信息相關聯，描述了NGS檢測導致最初臨床診斷更改的病例。
研究結果
在1007例患者中，59%為女性，41%為男性。測序時的平均年齡為67歲（標準差（SD）11.6歲；範圍24-100歲）。回顧了每例患者測序時的臨床分期。12例診斷為肺外原發性腫瘤的患者被排除在臨床分期分析之外。24例患者臨床分期沒有記錄或不確定。在剩餘的971例患者中，大多數為晚期，80%為IV期，12%為III期（圖1A）。
圖1. 臨床疑似非小細胞癌的臨床、病理和分子特徵。（A）臨床分期（B）組織病理學診斷 （C）癌基因驅動突變
組織病理學診斷包括812例腺癌（包括非小細胞癌，傾向腺癌）、66例低分化癌、63例非小細胞癌，未另行說明、30例鱗狀細胞癌（包括非小細胞癌，傾向鱗狀細胞癌）、10例大細胞神經內分泌癌、8例多形性癌、6例腺癌轉化為小細胞癌、4例非神經內分泌和神經內分泌混合型癌、3例腺鱗癌、2例非典型類癌、1例腺樣囊性癌、1例肌上皮癌和1例NUT癌（圖1B）。
致病性癌基因驅動突變包括KRAS（31.1%）、EGFR（23.3%）、MET（4.5%）、BRAF（3.2%）、ALK（2.2%）、RET（1.9%）、ERBB2（1.7%）、ROS1（1.3%）、NRAS（0.7%）和HRAS（0.4%）突變。驅動突變的總體分布與非小細胞癌中的預期頻率相當（圖1C）。
在1007例患者中，12例（1.2%）患者NGS檢測後臨床診斷更改。所有12例患者臨床均懷疑患有原發性肺癌。一些患者組織病理學特徵提示替代診斷，得到測序結果支持。另一些患者測序結果導致重新評估組織病理學診斷。分子結果與臨床病史、形態學和免疫組化特徵的相關性，以及與先前或額外的分子檢測結果的比較，支持更改診斷。支持診斷更改的證據包括識別UV特異性突變（n=6）、基因融合（n=2）和突變（n=4）。以下是對所有12例患者的總結。表中展現了每例患者的其他詳細信息。
最初臨床懷疑為非小細胞肺癌的肺外起源癌症的臨床、組織病理學和分子特徵
紫外線（UV）相關突變
在5例女性患者和1例男性患者的6例腫瘤標本中發現UV相關突變，這些患者的中位年齡為76歲（58-89歲）。這些腫瘤突變負荷較高（中位45個突變每兆鹼基；範圍，22-58）。最初病理診斷為鱗狀細胞癌（n=3）、非小細胞癌，傾向鱗狀細胞癌（n=1）、低分化基底細胞癌（n=1）以及惡性上皮樣和梭形細胞腫瘤（n=2）。測序前的病理報告均未提及皮膚部位來源轉移的可能性。
臨床記錄回顧顯示，5/6例患者有皮膚癌病史，包括皮膚基底細胞癌（n=5）、皮膚鱗癌（n=2）和黑色素瘤（n=1）。2/6例患者有>1種皮膚癌病史。第6例患者有鱗狀細胞癌病史，但未提及起源。結合測序結果後，綜合診斷包括轉移性皮膚鱗狀細胞癌（n=3；圖2A）、轉移性基底細胞癌（n=2；圖2B）和未分化黑色素瘤（n=1；圖2C）。未分化黑色素瘤患者先前的免疫組化檢測中角蛋白標記物S100和SOX10均為陰性。
圖2. 臨床疑似肺癌測序結果支持診斷更改。（A）皮膚鱗狀細胞癌（B）基底細胞癌（C）未分化黑色素瘤（D）甲狀腺癌（E）滑膜肉瘤（F）尿路上皮癌（G）肝細胞癌（H）胰腺腺癌（I）肝內膽管癌
基因融合
2例患者基於基因融合檢測結果診斷更改。一例50歲女性患者，有ALK重排肺腺癌以及更早時候甲狀腺癌病史，出現了一個新的肝臟腫塊。活檢顯示形態學與先前的肺癌相似，PAX8意外表達。測序顯示NCOA4::RET重排，無ALK重排。非小細胞肺癌中RET最常見的基因融合伴侶是KIF5B，其次是CCDC6。NCOA4::RET融合在肺癌中罕見，但在甲狀腺癌中常見。存在NCOA4::RET融合、不存在ALK基因融合以及PAX8表達符合轉移性甲狀腺癌（圖2D）。
一例48歲女性患者出現肺部腫塊。病理學上，肺部活檢顯示腫瘤角蛋白表達，診斷為低分化癌。測序顯示SS18::SSX1基因重排，螢光原位雜交證實這一結果。額外免疫組化顯示，腫瘤細胞TLE1陽性，診斷更改為滑膜肉瘤（圖2E）。
基因突變
4例患者基於基因突變檢測結果診斷更改。所有這些患者基於臨床病史和組織病理學，診斷不明確，最終測序結果輔助診斷。
一例82歲男性，有非侵襲性、低級別膀胱尿路上皮癌病史，出現新的肺部腫塊。由於先前活檢顯示膀胱腫瘤為低級別，未發現浸潤，臨床上認為該肺腫塊代表非相關原發性肺癌。肺部腫塊活檢和切除顯示腫瘤具有尿路上皮特徵，免疫組化GATA3表達。測序顯示FGFR3 p.S249C突變。綜合診斷為轉移性尿路上皮癌（圖2F）。
一例58歲男性，出現肺部腫塊、肝臟腫塊和骨轉移。股骨頭骨折病理報告顯示轉移癌HepPar1和Arginase1陽性。腫瘤細胞核TTF1表達陰性，細胞質TTF1表達陽性。診斷包括轉移性肝細胞癌vs轉移性肺肝樣腺癌。測序顯示CTNNB1 p.D32N突變和TERT啟動子突變。綜合診斷為轉移性肝細胞癌（圖2G）。
一例78歲女性，有胰腺癌病史，出現多發肺部腫塊。胰腺癌診斷先於出現肺部病變。2個肺部病灶活檢各顯示分化良好的粘液腺癌，難以區分是原發性肺粘液腺癌還是轉移性胰腺腺癌。測序顯示KRAS p.G12V突變。隨後的胰腺腫瘤測序也顯示KRAS p.G12V，同時存在多個共同的乘客變異ATM p.A2525F、POT1 p.P526del和RPTOR p.Q412Hfs*2。這些變異丰度在肺和胰腺標本中均在8%和20%之間，符合體細胞變異。綜合診斷為轉移性胰腺癌（圖2H）。
一例68歲男性，有KRAS p.G12C突變肺腺癌病史，出現新的肝臟腫塊。肝臟腫塊活檢顯示CK7陽性和TTF1陰性腺癌，原發部位不確定，最符合原發性肝膽腺癌或轉移性肺腺癌。測序顯示存在BAP1 c.581-2A>G突變，不存在KRAS突變。綜合診斷為肝內膽管癌（圖2I）。
診斷更改相關特徵
對這12例患者進行整體分析時，發現一些共同的特徵。10/12例患者有惡性腫瘤病史，其中2例有肺腺癌病史。儘管所有患者臨床上都懷疑為原發性肺癌，但只有1例患者病灶局限於肺部，9例患者有多個病灶。6例患者進行了肺外部位活檢。9例患者具有非腺癌形態，5例患者解剖病理報告顯示替代診斷可能。基於這一系列病例，對於有癌症病史，以及顯微鏡下發現不尋常組織病理學特徵的患者，考慮更改診斷的可能。
討 論
肺是轉移癌的常見部位。臨床和顯微鏡下，轉移癌可能與原發性肺癌相似。原發性肺癌的病理診斷可以基於結構和細胞形態學以及免疫組化；然而，原發性肺癌可能表現出異質性形態學特徵，肺譜系標誌物表達陰性，使其難以與轉移癌相區分。
本研究結果表明，一小部分被認為是原發性肺癌或臨床診斷不明確的癌症應在NGS檢測後重新評估。本研究隊列中，最常見的診斷更改原因包括發現UV相關突變，支持皮膚部位起源轉移。在先前的研究中，UV相關突變支持僅肺黑色素瘤患者轉移性黑色素瘤診斷，皮膚外源性癌症大型臨床測序資料庫也發現UV標誌物，提示皮膚部位起源的轉移癌可能未得到充分診斷。
儘管大多數皮膚癌臨床上表現出惰性行為，但在評估鱗狀細胞或基底細胞形態的肺部腫塊時，應考慮轉移性皮膚癌，尤其是對於有皮膚癌病史或長期暴露於陽光的患者。精確診斷轉移性皮膚癌和黑色素瘤很重要，因為這些癌症可能對免疫檢查點抑制劑治療敏感。
比較多個解剖部位基因融合和突變檢測結果促使本研究3例患者的臨床診斷。既往有研究基於分子變異確定相關性，包括區分多原發肺癌與肺內轉移。這些病例表明，比較多個部位的NGS結果可能有助於明確診斷，並可以輔助某些患者的臨床分期。使用分子結果分析多個腫瘤標本克隆關係時，可能需要結合臨床和組織學結果來確定原發部位。例如，按時間順序排列的腫瘤病史可以幫助判斷腫瘤是肺轉移灶還是已擴散到其他解剖位置的原發性肺部腫瘤。
本研究有局限性。本研究範圍僅限於臨床疑似肺癌，測序數據支持替代診斷。不包含臨床上懷疑另一個原發部位，但分子證據支持肺癌的情況。肺癌特異性突變的存在，如EGFR酪氨酸激酶結構域突變和吸煙相關突變，可能有助於原發性肺癌的診斷。有研究基於吸煙相關突變將SMARCA4缺陷型胸部腫瘤與原發性肺非小細胞癌聯繫起來。本研究表明，比較多個部位的測序結果可以為明確克隆關係提供信息，但並非隊列中所有患者都進行了多個部位測序。使用NGS等方法分析甲狀腺癌、尿路上皮癌和肝細胞癌患者的其他病理標本，有助於進一步證實綜合診斷。需要進行前瞻性研究，評估臨床上什麼情況下額外的分子檢測對最終診斷有用。
另一個局限是，本研究僅包括明確區分腫瘤類型的分子發現。許多分子變異，如TP53和KRAS突變，可見於多種腫瘤類型，因此不能可靠提示替代診斷。經驗證的整合複雜分子譜（包括序列變異、拷貝數變異、結構變異和特異性突變）的算法可能有助於篩選替代診斷。此外，腫瘤樣本中病毒DNA的存在可為診斷提供額外線索。有研究描述了癌症NGS標本中腫瘤相關病毒的脫靶捕獲，但這些方法尚未納入我們當前的信息渠道。
本研究隊列包括考慮為原發性肺癌的接受NGS檢測的患者。大多數患者處於晚期，92%的患者在檢測時疾病分期為III或IV期。大多數患者進行檢測尋求系統治療方案。因此，本研究人群並未反映出肺癌全貌，包括常規外科病理實踐中常見的早期癌症。早期肺癌通常接受手術切除，可以進行全面的病理檢查，具有特定的形態學特徵，如lepidic（貼壁）或原位生長模式。NGS檢測對早期肺癌病理診斷的價值可能低於對本研究隊列晚期患者的價值。
儘管本研究側重於臨床NGS檢測的診斷效用，但結果突出了病理專家（包括解剖和分子）在指導患者診療方面的作用。本研究納入的多個患者，外科病理鑑別診斷中考慮了肺外腫瘤，得到了分子病理學結果的支持。在某些情況下，如果無法獲得NGS檢測結果，使用額外的免疫組化標記物可以進一步支持診斷。我們認為，在癌症患者常規進行基因檢測的時代，病理專家將繼續在整合複雜的診斷數據方面發揮核心作用。隨著分子技術的日益普及，病理學家能夠幫助決定在臨床上什麼情況下分子檢測可以輔助診斷。
總之，本研究強調了腫瘤學和病理學持續存在的診斷挑戰。分子檢測不僅可以識別可靶向治療基因變異，還可以提供其他臨床相關信息，明確不明確的診斷或提出臨床或組織學上未考慮的替代診斷。隨著常規腫瘤診治實踐中先進分子檢測的可及性越來越高，臨床、顯微鏡和分子數據的多學科整合，對於複雜臨床場景輔助決策和晚期癌症患者治療選擇指導非常重要。
參考文獻：
Lo YC, Bauer AH, Odintsov I, Siegmund SE, Sholl LM, Dong F. Integrating Molecular Sequencing Into the Pathological Diagnosis of Clinically Suspected Non-Small Cell Lung Carcinomas. Mod Pathol. 2023 Feb 7;36(5):100126. doi: 10.1016/j.modpat.2023.100126. Epub ahead of print. PMID: 36842187.