放療是運用最為廣泛的基因毒性癌症療法。放射線所具有的能量會導致細胞DNA損傷，包括DNA雙鏈斷裂（DSB）、單鏈斷裂（SSB）和鏈間交聯，從而阻斷DNA複製和轉錄等，造成細胞死亡[1]。
由於G1/S檢查點關鍵調控因子p53的存在， 正常細胞在DNA損傷後將停滯在G1期（DNA合成前期），不進入S期（DNA合成期），並啟動DNA損傷修復機制。但在腫瘤細胞中， G1/S檢查點調控因子往往失去作用，使得腫瘤細胞很容易進入S期，因此放療導致的DNA損傷是腫瘤細胞的致命「毒藥」[2]。
而在臨床中，有許多腫瘤對放療不敏感。因此， 「狡猾的」腫瘤細胞必定在進入DNA合成期（S）之後，進入分裂期（M）之前（即G2期），找到了救命的辦法。
近日， 丹麥哥本哈根大學Claus S. Sørensen教授領銜的團隊在《科學》雜誌發表重磅研究成果，幫我們揭開了謎團。
他們發現， 腫瘤細胞在DNA被放射線破壞之後，會招募一種核酸酶（CAD）到DNA損傷處，主動切斷自身特定位點的DNA，阻止複製分裂的進行，使得腫瘤細胞停滯在G2期（DNA合成後期），為修復放療導致的DNA損傷贏得寶貴時間[3]。
這一顛覆性的研究，證實了腫瘤細胞在放射性DNA損傷的壓力下，存在一種「劍走偏鋒」的自救方式，並為改善放療效果提供了新的思路和靶點。
論文首頁截圖
其實在十餘年前，就有科學家發現在接受放療後，除了最開始的一波DNA損傷，細胞還存在第二波DNA損傷[4]，而造成這波延遲DNA損傷的原因一直不是很明確。
為了尋找放療後由DNA損傷誘導的G2/M檢查點調控因子，研究人員通過高通量siRNA對腫瘤細胞中已知的人核酸酶文庫進行篩選。篩選出排名第一的因子為RBBP8，一個已知的G2/M檢查點因子。
出乎意料的是， 排第二的因子是CAD（CAD是參與細胞凋亡過程中DNA斷裂的核酸酶，作為caspase信號級聯反應的效應者）， 一個之前被認為與DNA損傷反應或細胞周期檢查點調控無關的因子。
高通量siRNA對腫瘤細胞中已知的人核酸酶文庫進行篩選
CAD的出現引起了Sørensen和他同事的注意，他們猜測核酸酶CAD可能就是導致放療後細胞發生延遲DNA損傷的幕後主使，而且它能通過某種機制充當DNA損傷誘導的G2/M檢查點調控因子。
為了驗證這一點，研究人員對野生型和CAD-KO的人結直腸癌細胞HCT116進行放射性照射，發現野生型和CAD-KO細胞在照射後早期（10min-6h）的DNA損傷相似，但在 24小時後，野生型細胞出現了遠高於CAD-KO細胞的DNA損傷。這說明放療後的延遲DNA損傷很可能就是CAD介導的。
在接受放射24小時後，野生型細胞出現了遠高於CAD-KO細胞的DNA損傷
已有研究表明，在細胞中，CAD的激活通常是由caspase-3介導，它將CAD與ICAD（CAD抑制蛋白）分離，使CAD二聚化，進而裂解DNA。
然而，研究人員並沒有觀察到放療後caspase-3激活和ICAD蛋白水解的證據。此外，泛-caspase抑制劑也並不能抑制DNA的延遲損傷。這表明 放療後CAD的激活方式並非是依賴於caspase-3的經典途徑。
通過研究，Sørensen團隊發現， 在DNA損傷反應的介導下，CAD和ICAD都被招募到DNA斷裂的區域。而 ATM和ATR激酶（介導DNA損傷反應）活性的抑制或喪失可限制CAD/ICAD的招募，使得DNA斷裂減少。
通過蛋白質序列分析，研究人員發現 ICAD上存在可被ATM/ATR磷酸化的兩個高度保守的位點（Ser107和Ser257），並通過針對Ser107和Ser257位點設計的ICAD磷酸化特異性抗體，驗證了 這兩個位點在細胞受到放射性照射後都出現了廣泛的磷酸化，且磷酸化程度取決於ATM和ATR激酶的活性。
ICAD上存在可被ATM/ATR磷酸化的兩個高度保守的位點（Ser107和Ser257）
接著，研究人員設計了相應位點不能磷酸化的ICAD絲氨酸-丙氨酸突變細胞（S107A和S257A），以研究ICAD磷酸化的功能。將 突變細胞放射性照射後，突變的ICAD不能穩定地被招募到DNA損傷區。
以上結果表明， 依賴於ATR/ATM的ICAD的磷酸化是導致CAD/ICAD被招募到DNA損傷區的關鍵。
但問題來了，當CAD與ICAD結合時，其功能是受到抑制的啊？怎麼還會導致DNA斷裂呢？
原來是因為 CAD與ICAD結合時，其發揮DNA酶作用的結構域仍然暴露在外。而 常規情況下，CAD/ICAD二聚體是不會聚集在DNA區的，但當受到放射刺激後，DNA損傷反應使ICAD磷酸化，將CAD/ICAD招募到DNA損傷區，介導DNA斷裂。
DNA損傷後使CAD/ICAD招募到DNA損傷區，介導DNA斷裂
通過進一步研究，Claus S. Sørensen教授團隊發現 CAD介導的DNA斷裂是在特定位點 （位於染色質修飾的CCCTC結合因子位點附近）進行的 ，而非隨機分布於基因組中。這也從側面反應了這種自主的DNA斷裂是腫瘤細胞有「預謀」的進行的。
損傷的DNA位於特定位點（位於染色質修飾的CCCTC結合因子位點附近）
緊接著，研究人員探究了CAD是如何使腫瘤細胞停滯在G2期，而不進入M期。他們發現 在CAD介導細胞DNA斷裂後，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK1的抑制性磷酸化（Tyr15）減少，活化的檢查點因子CHK2減少，導致了細胞停滯在G2期。
不過，CAD對正常細胞的G2/M期的進行並不會有明顯影響，因為正常細胞擁有正常的p53和pRB通路，即有完善的G1/S檢查點，因此減少了對G2/M檢查點的依賴。
最後，研究人員通過使用人腫瘤異種移植小鼠模型在體內評估放射治療中CAD的功能。與細胞中的研究一致， 相比於CAD野生型腫瘤，CAD功能缺陷腫瘤中對放射治療更敏感。
相比於CAD野生型腫瘤，CAD功能缺陷腫瘤中對放射治療更敏感
總的來說，該研究發現並證實了腫瘤細胞在受到放療後的一種獨特的自救模式。在遭遇放療導致的DNA損傷後，腫瘤細胞中的CAD/ICAD在DNA損傷反應的介導下被招募到DNA損傷區，引發基因組中特定位點的DNA斷裂。
機制示意圖
雖然DNA斷裂對細胞來說通常是個壞消息，但 腫瘤細胞可能是在自主製造一些簡單易於修復的DNA損傷，使分裂旺盛的腫瘤細胞停滯在G2期，從而獲得足夠的時間來修復放療帶來的DNA損傷。可能這就是所謂的「大局觀」吧。
希望這一發現能幫助科學家找到腫瘤對放療耐受的解決方案，讓放療變得更有效。
參考文獻
1.Sharma RA, Plummer R, Stock JK, Greenhalgh TA, Ataman O, Kelly S, Clay R, Adams RA, Baird RD, Billingham L et al: Clinical development of new drug-radiotherapy combinations. Nat Rev Clin Oncol 2016, 13(10):627-642.
2.Halazonetis TD, Gorgoulis VG, Bartek J: An oncogene-induced DNA damage model for cancer development. Science 2008, 319(5868):1352-1355.
3.Larsen BD, Benada J, Yung PYK, Bell RAV, Pappas G, Urban V, Ahlskog JK, Kuo TT, Janscak P, Megeney LA et al: Cancer cells use self-inflicted DNA breaks to evade growth limits imposed by genotoxic stress. Science 2022, 376(6592):476-483.
4.Cieslar-Pobuda A, Saenko Y, Rzeszowska-Wolny J: PARP-1 inhibition induces a late increase in the level of reactive oxygen species in cells after ionizing radiation. Mutat Res 2012, 732(1-2):9-15.