如果說DNA是上帝造人的圖紙，那麼以CRISPR為代表的基因編輯技術就是上帝的手術刀。不過這把手術刀的也不是百分百精準，這也成為基因編輯技術臨床應用的一大障礙。
一直以來科學家都在追求更好、更實用的基因編輯方法，單鹼基編輯是其中一個。但正如這個名字所說的，單鹼基編輯只能編輯一個鹼基，而且4個鹼基總共12種變化中，能實現的只有4種，嘌呤和嘧啶間相互轉換的8種統統做不到。
最近科學家將CRISPR與逆轉錄結合在一起，實現了所用鹼基間的自由轉換，編輯脫靶和插入缺失的問題也有了很大的改善。這一研究發表在Nature上[1]。
（來自sciencemag.org）
CRISPR這個名字，最初指的是大腸桿菌里一種奇怪的重複基因序列。直到2010年人們才搞清了它的作用，這些序列實際是細菌儲存的病毒DNA片段。它轉錄出的嚮導RNA與切割DNA的Cas蛋白結合，把Cas蛋白帶到入侵的病毒DNA上，切斷病毒的DNA，是細菌的免疫系統。
嚮導RNA+Cas蛋白這樣的組合，只要改改嚮導RNA的序列就可以把Cas帶到不同的位置，這不就是基因編輯的絕好工具嗎？確實，CRISPR迅速成為了一個大熱的基因編輯工具，操作十分簡單，甚至生物愛好者自己在家都能完成。
不過CRISPR用來基因編輯卻也並不完美。近年來有研究指出，CRISPR基因編輯有可能會激活p53系統，因此最終成功編輯的可能是那些p53功能缺陷的潛在癌細胞！
而且常用的CRISPR/Cas9系統，對於嚮導RNA的匹配要求並不十分嚴格，Cas9也有可能不遵守RNA的指引胡亂切割，造成編輯的脫靶，甚至編輯位點遠端的大段丟失。
至於單鹼基編輯，那是把Cas蛋白的DNA切割功能去掉，接上個嘧啶脫氨酶等等直接改變鹼基的酶，CT互變、AG互變，都可以在不切斷DNA鏈的情況下進行。但對於C/TA/G這樣嘌呤和嘧啶間的轉化就無能為力了。
而且，單鹼基編輯器存在一個編輯窗口，要是窗口裡有好幾個可以編輯的鹼基，編輯的選擇性就很差了，也存在脫靶的問題。此外，如果是想插入或刪除幾個鹼基，目前還沒有能避免雙鏈斷裂的方法去實現。
不過這些問題都被劉如謙解決了。他一方面對Cas蛋白進行了修改，讓其只能切斷DNA雙鏈中的一條鏈。另一方面，他還在嚮導RNA上接上了一段要添加的DNA的模板RNA，成為編輯擴展嚮導RNA（pegRNA），相應的在Cas上加上了一個逆轉錄酶，利用模板RNA逆轉錄出來的DNA去修複目標位點。
PE編輯技術的基本原理
（圖源：Susanna Hamilton, Broad Institute）
這一套基因編輯系統被命名為PE。而且在改進的過程中，誕生了PE1、PE2和PE3，三代編輯工具。其中PE1和PE2隻能切開一條DNA鏈，PE3在PE2的基礎上加了一份sgRNA，可以切斷非編輯鏈，提高了編輯效率。至於效果怎麼樣，還得看試驗數據說話。
PE3編輯技術的示意圖
研究人員首先測試了PE的單鹼基編輯能力。相比於傳統的嘧啶編輯器，PE對於編輯窗中心的鹼基的編輯效果較差，編輯效率不到其一半。不過對於編輯窗邊緣的鹼基，PE3的效率是傳統方法的2.7倍，意外的插入和缺失也較少。而且PE不會影響編輯窗內的其它同種鹼基，編輯的精確性更高。
PE與嘌呤編輯器的比較也得出了類似的結果。
對於CRISPR的脫靶問題，理論上，PE的編輯中總共要有三次鹼基互補配對：先是pegRNA中嚮導序列和靶DNA配對定位，然後靶DNA和pegRNA中的引物序列配對開始逆轉錄，最後逆轉錄形成的DNA和靶DNA配對完成編輯，應當能很好的避免脫靶。
事實也果真如此。在對攜帶16個已知的CRISPR脫靶位點的4個基因編輯靶外的測試中，PE對兩個靶點編輯的脫靶率都低於0.1%，脫靶率最高也不過2.2%。相比之下，CRISPR+Cas9的基因編輯，脫靶率在4.3%~60%不等。
PE編輯的脫靶率很低
接下來，研究人員嘗試利用PE去修復了幾種常見的單基因遺傳病。
鐮狀紅細胞貧血是血紅蛋白基因中一個A·TT·A轉位引起的，導致β球蛋白中的E6V突變。這樣的轉位，通過單鹼基編輯是無法修復的。而使用PE對其進行編輯修復的有效率可以達到58%，只有1.4%出現了意外的插入或缺失。
Tay-Sachs病是一種常染色體隱性遺傳病，患兒常常在6個月內出現大腦發育紊亂，在3歲左右死亡。它是由HEXA基因中一個4鹼基的插入引起的，PE對這一基因異常的修復也達到了33%的有效率，插入和缺失只有0.32%。
相比於傳統的CRISPR/Cas9切割+同源重組修復，PE的編輯/插入缺失比例大約高出了270倍，編輯的準確性大大提高。而且由於PE的適用範圍十分廣泛，研究人員估計，大約89%的人類遺傳病基因突變，都有可能可以通過PE糾正。
目前，這一基因編輯技術已經授權給了Prime Medicine公司進行開發。
（此文為轉載）