人的大腦宛如宇宙一樣，複雜而神秘。我們的大腦發育究竟經歷了怎樣的過程？各種腦類疾病又是如何產生的？從大學起，李沖就對神經系統產生了濃厚的興趣，並一直致力於疾病的致病機理研究。
最近，在奧地利科學院分子生物科技研究所從事博士後研究的他以共同第一作者和共同通訊作者在 Nature 上發表了一篇論文。
研究中，李沖和所在團隊將高通量基因編輯 CRISPR/CAS9 技術和單細胞組學技術聯合應用在 3D 人腦類器官中，開發出一種名為 CHOOSE（CRISPR-human organoids-scRNA-seq）的系統，並利用這一系統探索了自閉症（又名孤獨症）的發病機制。
圖 | 李沖（來源：李沖）
這一成果能幫助人們進一步理解自閉症可能的致病原因，加深對於自閉症致病基因的功能的認知。
同時，本次系統對於在類器官中進行高通量基因編輯和單細胞組學的聯合應用，起到了重要的推進作用。
此外，這一系統也能用於不同的類器官系統里比如心臟、肺、小腸等，能夠加速對於基因功能在複雜組織里的全面研究，並能加速人類對於致病基因功能的認識。
同樣重要的是，類器官技術是一個以人類組織為平台的研究模式。相比以往在動物模型里進行研究，本次工作更能觀察到一些人類特有的生物現象。
（來源：Nature）
發現與自閉症基因相關的細胞類型和調控網絡變化
詳細來說，CHOOSE 這一系統可以平行地在類器官中的每一個細胞中進行不同的基因敲除。假如將其想像成一種馬賽克組織，組織中的每一個細胞都有一個特定的基因被編輯。
經過一段時間的培養和組織分化以後，就可以對類器官中每一個進行過基因編輯的細胞進行單細胞轉錄組測序。
單細胞轉錄組測序技術，是一種在近年來得到快速發展的基因組學技術。它可以全面、定量地針對細胞類型、細胞狀態、細胞內的生物學通路，在單細胞水平上開展分析，從而提供大量的生物學信息。
在 CHOOSE 系統的幫助之下，可以一次性針對大量基因同時進行深入、全面的表型分析，從而大大加速對於致病基因的研究速度和研究深度。
研究中，利用 CHOOSE 這一系統課題組研究了自閉症的致病基因。據了解，自閉症的發病率非常高，而且是所有神經發育疾病中遺傳因素較高的一種。
目前，人類對於自閉症的發病機理知之甚少。自閉症患者被確診的時候往往在 3 歲以後，這時患者的大腦發育已經基本結束。
這時就無法知道自閉症患者的大腦在發育時到底發生了什麼。不過，越來越多的動物模型證據表明，早期自閉症患者的大腦發育受到了影響。
目前已知的自閉症相關基因超過 1000 個，該團隊從中選取 36 個基因。它們具有高度的致病性，並且和基因轉錄表達存在相關性。
隨後，他們使用 CHOOSE 系統建立了一個 CRISPR 庫，在幹細胞里敲除這些基因（每一個細胞里只有 1 個基因被敲除）。之後，使用這些幹細胞在體外培養類腦器官，分化成為大腦皮層組織。
四個月後，這些組織中已經分化出既複雜、又成熟的細胞類型（共有 16 種）。隨後，他們對組織加以處理並進行單細胞測序。
通過數據分析，他們發現了很多有意思的現象。首先，他們發現所有致病基因，並不都是通過同一種方式來影響大腦發育。
比如，當不同基因被敲除以後，可以影響不同的細胞類型。這說明自閉症的致病原因並不是只有一種。
同時，他們還發現在自閉症基因被敲除後，有些細胞類型更加容易受到影響。比如，當有多個基因被敲除後，一種中間神經幹細胞（IPC，Intermediate progenitor cells）的百分比都會被降低。
這種 IPC 在人腦中具有重要作用，它可以分化成大腦皮層中不同層的興奮神經元，並且可以參與到人腦皮層的擴大之中。
這也可能在間接地提示，這種人腦特有的發育過程也參與了人類腦疾病比如自閉症的發生。
之後，課題組利用單細胞測序的優勢，進行了轉錄組的深入分析，描繪了每一個自閉症基因被敲除之後轉錄組發生的變化，並生成了強大的表型資料庫，能夠幫助人們更好地研究這些致病基因。
最後，他們又整合了單細胞染色質開放和轉錄組的情況，基於此開展了針對基因調控網絡的分析，藉此發現了一些和自閉症基因相關的調控網絡的變化情況。
眾所周知，人的大腦是最複雜的器官之一。那麼，為什麼李沖等人選擇了這樣一個課題？
（來源：Nature）
填補大腦研究的空白之一
的確，無論是研究人腦發育、研究人腦功能、還是研究腦相關疾病都是高難度的課題。其中一個重要原因就是對於發育中的人腦，人們始終無法在分子水平和細胞水平進行觀察和分析。
目前，人們對於人腦發育的認知，大部分是從各種模式生物例如小鼠的研究中發現的。
但是，人腦發育有著一定的特殊性。很多時候在動物模型中的發現，不能很好地詮釋人腦發育的現象，尤其是在研究人腦疾病的致病和發病機理方面。
為了克服這些困難，李沖的博士後導師——奧地利科學院分子生物科技研究所教授尤根·A. 諾布里克（Jürgen A. Knoblich）和團隊，曾在 10 年前首次利用多功能幹細胞在體外進行誘導，藉此分化並培養出一種三維類人腦器官。
這些類腦器官對於研究人腦有著巨大優勢，它們能很好地模擬早期人大腦的發育的過程，不僅呈現出體內發育的結構性特徵，更能高保真地分化出很多細胞類型。
由此可見，類器官是一種可被用於模擬人腦發育的模型。而且，通過利用不同的分化因子，這些類腦器官可以特定地進行分化，從而誘導形成不同的腦區，以用於研究不同神經元的功能。
更重要地是，當把這一模型分化在不同腦細胞中，即可模擬整個體內發育的動態過程。這樣一來，就能全面系統地在不同發育時期開展觀察分析。
由於類器官在組織和細胞上都比較複雜，因此需要高分辨的研究手段。而且類器官往往需要長時間的體外培養（2-6 個月甚至更長），這給學界帶來了巨大挑戰。
目前，類器官已被廣泛用於遺傳型腦疾病的研究。但是，目前已知的致病基因有成百上千種，如果對每一致病基因逐個研究，不僅耗時耗力更重要的是限制了人們對於治病基因以及大腦發育的理解。
所以，迫切需要一種高通量、高分辨的定量方法，來加速我們對於基因在大腦發育中的功能研究，而本次工作則極大地填補了這一空白。
（來源：Nature）
培養一批類器官，耗時長達 4 個月
「不積跬步，無以至千里。」做科研更是如此，研究伊始對於開展長期體外培養、並在器官組織水平上進行高通量單細胞篩選分析，課題組其實並沒有太多經驗。
而類器官經過長期的分化，導致細胞類型比較多樣。因此這個課題是一個非常複雜、非常精細的高風險項目。每一步都必須穩打穩紮，才能確保獲得高質量的數據。
為此，他們在可行性上進行了大量的摸索優化，通過提高基因的編輯效率，優化類器官水平上的遺傳學設計，以便保證基因原件在最終分化的組織中，能夠有效地表達並且能被監測到。
同時，還需要針對實驗設計進行反覆推敲，確保最終有足夠的樣本進行有統計學意義的分析。此外，直到類器官發育到 4 個月的時候才能進行樣本分析，所以很多驗證性實驗非常耗時。
對於如何選擇要靶向的基因，該團隊也進行了反覆思考。由於他們對腦疾病的機理非常感興趣，所以選擇以自閉症為研究對象，著重研究一批高致病性致病基因。
因為這些基因的致病性在此前的大規模人群測序研究中已經得到確認，只是具體的致病機制不詳。
由於不少實驗都非常耗時，很多時候需要提前半年或提前更長時間進行規劃，提前預約實驗儀器設備、以及聯繫相關輔助人員。
當這些類腦器官發育 4 個月以後，他們開始對組織進行單細胞測序。在初步分析結果中，他們看到了一些很有意思的表型，比如很多基因的編輯會導致細胞命運的變化。
李沖等人對此感到特別興奮。為了能夠更加系統性地進行定量，他們和瑞士蘇黎世聯邦理工學院的同行開展合作。
通過這一合作，他們不僅在細胞類型組成上進行了全面的比較，也利用單細胞轉錄組的強大信息探索了下游信號通路變化。
同時，合作者也開始將他們剛剛開發的基因調控網絡分析方法用到實驗分析之中，藉此得到了和自閉症相關的調控網絡。
在利用生物信息學進行定量分析時，他們發現了一個有意思的現象：三個 BAF complex 的組成蛋白的敲除導致了相似的表型變化。
期間，他們一直思考在篩查中發現的現象，是不是也存在於真實世界之中？換句話說，本次研究能否為某些疾病的發生提供一些機制上的支持。
幸運的是，課題組找到了兩位存在 ARID1B 突變（位於 6 號染色體的基因）的患者。於是，他們從患者身上提取體細胞，並重編程成為幹細胞，再發育成為類腦器官。
後來，他們在這兩名患者細胞發育的類腦器官里都看到了相似的表型，這讓整個研究團隊都非常興奮。
因為他們在 CHOOSE 系統中篩查到表型和在病人樣本中看到的是一致的，這再次印證了本次系統對於研究人類致病基因功能的可用性。
（來源：Nature）
最終，相關論文以《單細胞腦類器官篩查識別自閉症的發育缺陷》（Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism）為題發在 Nature[1]。
圖 | 相關論文（來源：Nature）
李沖是共同第一作者兼共同通訊作者，奧地利科學院分子生物科技研究所教授尤爾根·A. 諾布里克（Jürgen A. Knoblich）和瑞士蘇黎世聯邦理工學院教授芭芭拉·特魯特萊因（Barbara Treutlein）擔任共同通訊作者。
參考資料：
1.Li, C., Fleck, J.S., Martins-Costa, C.et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature 621, 373–380 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06473-y