在晚期非小细胞肺癌中，分子检测已在临床实践中得到应用，用于发现可治疗的分子变异。意外的分子结果可能导致临床诊断的重新考虑；然而，这种情况尚未得到系统研究。本研究回顾了1007例考虑为非小细胞肺癌的连续患者的NGS检测结果，以及相应的临床病史和解剖病理结果。1007例患者中有12例（1.2%）最终诊断为肺外起源的癌症。支持最终诊断的分子证据包括发现紫外线（UV）辐射相关突变（n=6）、基因融合（n=2）和突变（n=4）。综合诊断包括未分化黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、肝细胞癌、胰腺癌、肝内胆管癌和滑膜肉瘤。在临床考虑为非小细胞肺癌的患者中，有一小部分在临床NGS检测后最终被诊断为肺外起源的癌症，这不容忽视。临床、显微镜和分子证据的整合可以辅助诊断并指导个体化治疗。
研究背景
在晚期非小细胞肺癌临床实践中，下一代测序（NGS）技术已得到迅速应用，用于指导患者的靶向治疗选择。临床实践指南支持NGS的使用。实验室正在开发和验证临床癌症NGS检测。美国大多数肿瘤学专家在患者诊疗过程中使用NGS。
开发了肿瘤NGS panel用于临床识别可靶向治疗的分子变异。传统上，可靶向治疗变异包括致癌基因突变和基因融合，其组成性激活细胞生存通路，是小分子抑制剂的直接靶点。截至2022年，FDA批准的晚期肺癌靶向药物靶点包括EGFR、KRAS p.G12C、MET外显子14跳跃、BRAF p.V600E和ERBB2突变，以及ALK、ROS1和RET基因融合。
传统的解剖病理学将临床病史、大体病理学、组织病理学和免疫组化纳入最终病理诊断。尽管在大多数情况下可以确定起源和细胞谱系，但也存在局限性。3%至5%的肿瘤原发部位无法通过病理学确定，大多数原发灶不明癌患者预后不良。在非小细胞肺癌的诊断中，谱系特异性标记物（TTF1和napsin A）对肺腺癌的敏感性有限，鳞状细胞癌常用标记物（p63和p40）在不同原发部位的鳞状细胞癌中表达。在临床实践中，免疫组化在肺癌诊断中的应用程度不同。
与针对单个基因的分子检测相比，NGS检测覆盖数百个基因，为临床诊疗提供信息，例如识别罕见驱动基因变异和特异性突变。在某些临床情境中，NGS结果提示的诊断可能与临床或组织学诊断相矛盾。而NGS结果辅助诊断的能力尚未得到系统评估。
本研究报告了一组考虑为非小细胞肺癌患者的临床NGS检测结果。我们将分子结果与临床和病理信息相关联，描述了NGS检测导致最初临床诊断更改的病例。
研究结果
在1007例患者中，59%为女性，41%为男性。测序时的平均年龄为67岁（标准差（SD）11.6岁；范围24-100岁）。回顾了每例患者测序时的临床分期。12例诊断为肺外原发性肿瘤的患者被排除在临床分期分析之外。24例患者临床分期没有记录或不确定。在剩余的971例患者中，大多数为晚期，80%为IV期，12%为III期（图1A）。
图1. 临床疑似非小细胞癌的临床、病理和分子特征。（A）临床分期（B）组织病理学诊断 （C）癌基因驱动突变
组织病理学诊断包括812例腺癌（包括非小细胞癌，倾向腺癌）、66例低分化癌、63例非小细胞癌，未另行说明、30例鳞状细胞癌（包括非小细胞癌，倾向鳞状细胞癌）、10例大细胞神经内分泌癌、8例多形性癌、6例腺癌转化为小细胞癌、4例非神经内分泌和神经内分泌混合型癌、3例腺鳞癌、2例非典型类癌、1例腺样囊性癌、1例肌上皮癌和1例NUT癌（图1B）。
致病性癌基因驱动突变包括KRAS（31.1%）、EGFR（23.3%）、MET（4.5%）、BRAF（3.2%）、ALK（2.2%）、RET（1.9%）、ERBB2（1.7%）、ROS1（1.3%）、NRAS（0.7%）和HRAS（0.4%）突变。驱动突变的总体分布与非小细胞癌中的预期频率相当（图1C）。
在1007例患者中，12例（1.2%）患者NGS检测后临床诊断更改。所有12例患者临床均怀疑患有原发性肺癌。一些患者组织病理学特征提示替代诊断，得到测序结果支持。另一些患者测序结果导致重新评估组织病理学诊断。分子结果与临床病史、形态学和免疫组化特征的相关性，以及与先前或额外的分子检测结果的比较，支持更改诊断。支持诊断更改的证据包括识别UV特异性突变（n=6）、基因融合（n=2）和突变（n=4）。以下是对所有12例患者的总结。表中展现了每例患者的其他详细信息。
最初临床怀疑为非小细胞肺癌的肺外起源癌症的临床、组织病理学和分子特征
紫外线（UV）相关突变
在5例女性患者和1例男性患者的6例肿瘤标本中发现UV相关突变，这些患者的中位年龄为76岁（58-89岁）。这些肿瘤突变负荷较高（中位45个突变每兆碱基；范围，22-58）。最初病理诊断为鳞状细胞癌（n=3）、非小细胞癌，倾向鳞状细胞癌（n=1）、低分化基底细胞癌（n=1）以及恶性上皮样和梭形细胞肿瘤（n=2）。测序前的病理报告均未提及皮肤部位来源转移的可能性。
临床记录回顾显示，5/6例患者有皮肤癌病史，包括皮肤基底细胞癌（n=5）、皮肤鳞癌（n=2）和黑色素瘤（n=1）。2/6例患者有>1种皮肤癌病史。第6例患者有鳞状细胞癌病史，但未提及起源。结合测序结果后，综合诊断包括转移性皮肤鳞状细胞癌（n=3；图2A）、转移性基底细胞癌（n=2；图2B）和未分化黑色素瘤（n=1；图2C）。未分化黑色素瘤患者先前的免疫组化检测中角蛋白标记物S100和SOX10均为阴性。
图2. 临床疑似肺癌测序结果支持诊断更改。（A）皮肤鳞状细胞癌（B）基底细胞癌（C）未分化黑色素瘤（D）甲状腺癌（E）滑膜肉瘤（F）尿路上皮癌（G）肝细胞癌（H）胰腺腺癌（I）肝内胆管癌
基因融合
2例患者基于基因融合检测结果诊断更改。一例50岁女性患者，有ALK重排肺腺癌以及更早时候甲状腺癌病史，出现了一个新的肝脏肿块。活检显示形态学与先前的肺癌相似，PAX8意外表达。测序显示NCOA4::RET重排，无ALK重排。非小细胞肺癌中RET最常见的基因融合伴侣是KIF5B，其次是CCDC6。NCOA4::RET融合在肺癌中罕见，但在甲状腺癌中常见。存在NCOA4::RET融合、不存在ALK基因融合以及PAX8表达符合转移性甲状腺癌（图2D）。
一例48岁女性患者出现肺部肿块。病理学上，肺部活检显示肿瘤角蛋白表达，诊断为低分化癌。测序显示SS18::SSX1基因重排，荧光原位杂交证实这一结果。额外免疫组化显示，肿瘤细胞TLE1阳性，诊断更改为滑膜肉瘤（图2E）。
基因突变
4例患者基于基因突变检测结果诊断更改。所有这些患者基于临床病史和组织病理学，诊断不明确，最终测序结果辅助诊断。
一例82岁男性，有非侵袭性、低级别膀胱尿路上皮癌病史，出现新的肺部肿块。由于先前活检显示膀胱肿瘤为低级别，未发现浸润，临床上认为该肺肿块代表非相关原发性肺癌。肺部肿块活检和切除显示肿瘤具有尿路上皮特征，免疫组化GATA3表达。测序显示FGFR3 p.S249C突变。综合诊断为转移性尿路上皮癌（图2F）。
一例58岁男性，出现肺部肿块、肝脏肿块和骨转移。股骨头骨折病理报告显示转移癌HepPar1和Arginase1阳性。肿瘤细胞核TTF1表达阴性，细胞质TTF1表达阳性。诊断包括转移性肝细胞癌vs转移性肺肝样腺癌。测序显示CTNNB1 p.D32N突变和TERT启动子突变。综合诊断为转移性肝细胞癌（图2G）。
一例78岁女性，有胰腺癌病史，出现多发肺部肿块。胰腺癌诊断先于出现肺部病变。2个肺部病灶活检各显示分化良好的粘液腺癌，难以区分是原发性肺粘液腺癌还是转移性胰腺腺癌。测序显示KRAS p.G12V突变。随后的胰腺肿瘤测序也显示KRAS p.G12V，同时存在多个共同的乘客变异ATM p.A2525F、POT1 p.P526del和RPTOR p.Q412Hfs*2。这些变异丰度在肺和胰腺标本中均在8%和20%之间，符合体细胞变异。综合诊断为转移性胰腺癌（图2H）。
一例68岁男性，有KRAS p.G12C突变肺腺癌病史，出现新的肝脏肿块。肝脏肿块活检显示CK7阳性和TTF1阴性腺癌，原发部位不确定，最符合原发性肝胆腺癌或转移性肺腺癌。测序显示存在BAP1 c.581-2A>G突变，不存在KRAS突变。综合诊断为肝内胆管癌（图2I）。
诊断更改相关特征
对这12例患者进行整体分析时，发现一些共同的特征。10/12例患者有恶性肿瘤病史，其中2例有肺腺癌病史。尽管所有患者临床上都怀疑为原发性肺癌，但只有1例患者病灶局限于肺部，9例患者有多个病灶。6例患者进行了肺外部位活检。9例患者具有非腺癌形态，5例患者解剖病理报告显示替代诊断可能。基于这一系列病例，对于有癌症病史，以及显微镜下发现不寻常组织病理学特征的患者，考虑更改诊断的可能。
讨 论
肺是转移癌的常见部位。临床和显微镜下，转移癌可能与原发性肺癌相似。原发性肺癌的病理诊断可以基于结构和细胞形态学以及免疫组化；然而，原发性肺癌可能表现出异质性形态学特征，肺谱系标志物表达阴性，使其难以与转移癌相区分。
本研究结果表明，一小部分被认为是原发性肺癌或临床诊断不明确的癌症应在NGS检测后重新评估。本研究队列中，最常见的诊断更改原因包括发现UV相关突变，支持皮肤部位起源转移。在先前的研究中，UV相关突变支持仅肺黑色素瘤患者转移性黑色素瘤诊断，皮肤外源性癌症大型临床测序数据库也发现UV标志物，提示皮肤部位起源的转移癌可能未得到充分诊断。
尽管大多数皮肤癌临床上表现出惰性行为，但在评估鳞状细胞或基底细胞形态的肺部肿块时，应考虑转移性皮肤癌，尤其是对于有皮肤癌病史或长期暴露于阳光的患者。精确诊断转移性皮肤癌和黑色素瘤很重要，因为这些癌症可能对免疫检查点抑制剂治疗敏感。
比较多个解剖部位基因融合和突变检测结果促使本研究3例患者的临床诊断。既往有研究基于分子变异确定相关性，包括区分多原发肺癌与肺内转移。这些病例表明，比较多个部位的NGS结果可能有助于明确诊断，并可以辅助某些患者的临床分期。使用分子结果分析多个肿瘤标本克隆关系时，可能需要结合临床和组织学结果来确定原发部位。例如，按时间顺序排列的肿瘤病史可以帮助判断肿瘤是肺转移灶还是已扩散到其他解剖位置的原发性肺部肿瘤。
本研究有局限性。本研究范围仅限于临床疑似肺癌，测序数据支持替代诊断。不包含临床上怀疑另一个原发部位，但分子证据支持肺癌的情况。肺癌特异性突变的存在，如EGFR酪氨酸激酶结构域突变和吸烟相关突变，可能有助于原发性肺癌的诊断。有研究基于吸烟相关突变将SMARCA4缺陷型胸部肿瘤与原发性肺非小细胞癌联系起来。本研究表明，比较多个部位的测序结果可以为明确克隆关系提供信息，但并非队列中所有患者都进行了多个部位测序。使用NGS等方法分析甲状腺癌、尿路上皮癌和肝细胞癌患者的其他病理标本，有助于进一步证实综合诊断。需要进行前瞻性研究，评估临床上什么情况下额外的分子检测对最终诊断有用。
另一个局限是，本研究仅包括明确区分肿瘤类型的分子发现。许多分子变异，如TP53和KRAS突变，可见于多种肿瘤类型，因此不能可靠提示替代诊断。经验证的整合复杂分子谱（包括序列变异、拷贝数变异、结构变异和特异性突变）的算法可能有助于筛选替代诊断。此外，肿瘤样本中病毒DNA的存在可为诊断提供额外线索。有研究描述了癌症NGS标本中肿瘤相关病毒的脱靶捕获，但这些方法尚未纳入我们当前的信息渠道。
本研究队列包括考虑为原发性肺癌的接受NGS检测的患者。大多数患者处于晚期，92%的患者在检测时疾病分期为III或IV期。大多数患者进行检测寻求系统治疗方案。因此，本研究人群并未反映出肺癌全貌，包括常规外科病理实践中常见的早期癌症。早期肺癌通常接受手术切除，可以进行全面的病理检查，具有特定的形态学特征，如lepidic（贴壁）或原位生长模式。NGS检测对早期肺癌病理诊断的价值可能低于对本研究队列晚期患者的价值。
尽管本研究侧重于临床NGS检测的诊断效用，但结果突出了病理专家（包括解剖和分子）在指导患者诊疗方面的作用。本研究纳入的多个患者，外科病理鉴别诊断中考虑了肺外肿瘤，得到了分子病理学结果的支持。在某些情况下，如果无法获得NGS检测结果，使用额外的免疫组化标记物可以进一步支持诊断。我们认为，在癌症患者常规进行基因检测的时代，病理专家将继续在整合复杂的诊断数据方面发挥核心作用。随着分子技术的日益普及，病理学家能够帮助决定在临床上什么情况下分子检测可以辅助诊断。
总之，本研究强调了肿瘤学和病理学持续存在的诊断挑战。分子检测不仅可以识别可靶向治疗基因变异，还可以提供其他临床相关信息，明确不明确的诊断或提出临床或组织学上未考虑的替代诊断。随着常规肿瘤诊治实践中先进分子检测的可及性越来越高，临床、显微镜和分子数据的多学科整合，对于复杂临床场景辅助决策和晚期癌症患者治疗选择指导非常重要。
参考文献：
Lo YC, Bauer AH, Odintsov I, Siegmund SE, Sholl LM, Dong F. Integrating Molecular Sequencing Into the Pathological Diagnosis of Clinically Suspected Non-Small Cell Lung Carcinomas. Mod Pathol. 2023 Feb 7;36(5):100126. doi: 10.1016/j.modpat.2023.100126. Epub ahead of print. PMID: 36842187.