胶质瘤是最常见的恶性中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤是最常见和最具侵袭性的。胶质母细胞瘤的复发率很高，常规治疗是手术后替莫唑胺加放疗，且鲜有二线治疗方案能提供持久的临床获益。胶质母细胞瘤具有分子异质性，易发生基因变异，包括TP53、PTEN和IDH突变，以及MGMT启动子甲基化。虽然这些基因变异的确切作用尚未得到证实，但已有研究显示可能与较差的预后和/或标准治疗的反应相关。
此外，有研究显示ErbB通路失调在胶质母细胞瘤中也起作用。高达57%的胶质母细胞瘤患者携带EGFR突变、重排、剪接变异和/或局灶性扩增。在约60%的原发性胶质母细胞瘤中发现EGFR过表达。研究显示，EGFR变异III（EGFRvIII）突变可加重患者预后。因此，研究了多种抑制ErbB通路信号的治疗方法，包括使用小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）靶向抑制EGFR。然而，第一代可逆性EGFR TKIs吉非替尼和厄洛替尼在复发或新诊断的胶质母细胞瘤患者中作为单药或联合替莫唑胺或放化疗未显示疗效。这可能是由于大多数TKIs无法穿透血脑屏障，限制了有效的药物传递。一项研究显示，吉非替尼虽然以足够高的浓度到达肿瘤组织使EGFR去磷酸化，但不能调节下游信号传感器的激活。
阿法替尼是第二代ErbB家族抑制剂，不可逆地抑制EGFR、HER2和HER4，并抑制HER3的转磷酸化。在临床前研究中，阿法替尼可抑制恶性胶质瘤中常见突变细胞增殖，包括EGFRvIII和R108K。此外，非小细胞肺癌（NSCLC）的临床前和临床证据表明，阿法替尼在浓度足以抑制肿瘤生长的情况下，可以穿透血脑屏障。两项临床试验评估了阿法替尼对恶性胶质瘤患者的疗效：一项I/II期研究，阿法替尼联合或不联合替莫唑胺治疗复发性胶质母细胞瘤（NCT00727506；研究1200.36）；一项I期研究，阿法替尼加放疗，联合或联合替莫唑胺治疗新确诊胶质母细胞瘤（NCT00977431；研究1200.38）。这两项研究的总体结果之前已发表。在复发性胶质母细胞瘤试验中（研究1200.36），无论是单药还是联合替莫唑胺，在未筛选的患者中观察到阿法替尼的疗效有限。然而，有证据表明某些患者群体可能表现出更好的反应。与EGFRvIII阴性肿瘤相比，对于EGFRvIII突变具有高度免疫反应性的肿瘤患者，阿法替尼+替莫唑胺的中位无进展生存期（mPFS）更长（3.65个月vs 1.05个月）。在EGFR扩增或PTEN缺失患者中，阿法替尼联合替莫唑胺治疗的中位PFS均为2.73个月，而替莫唑胺单药治疗的中位PFS分别为1.02和1.87个月。在研究1200.38中，接受阿法替尼加放疗联合替莫唑胺治疗和不联合替莫唑胺治疗的患者，疾病进展的中位时间分别为14.3个月和6.9个月。
在研究1200.36中，有一例58岁的多发原发性胶质母细胞瘤女性患者在使用阿法替尼联合替莫唑胺治疗后长期获益：该患者有几个EGFR变异，包括EGFR扩增和EGFRvIII突变阳性，在结果发表时，患者治疗63个周期后仍在治疗。
考虑到胶质母细胞瘤对阿法替尼反应的异质性，研究者使用下一代测序(NGS)来研究癌症基因突变谱与在研究1200.36和1200.38中特定患者对阿法替尼治疗获长期反应之间的潜在联系。在本报告中，研究者描述了来自新确诊胶质母细胞瘤试验（研究1200.38）且对阿法替尼有长期反应的两个病例，并提供了一例患者（来自研究1200.36）超过2年额外随访的更新数据。
研究方法
在纳入研究1200.38的36例患者中，有5例患者对阿法替尼有长期反应（＞12个月）。其中，有2名患者的肿瘤样本是在确诊时采集的。此外，在研究1200.36中，有一名患者先前对阿法替尼联合替莫唑胺有持续反应，其肿瘤样本可获得。对于该患者，肿瘤样本是在诊断时获得的，并在阿法替尼治疗多个周期后病情进展后进行手术切除。从确诊时获得的标本中分离DNA进行NGS。对研究1200.36中患者病情进展后手术切除样本进行全外显子组测序分析。
表1
病例1（研究1200.38）
一名62岁男性，最初表现为癫痫发作，影像学显示左侧额叶病变。在3个月的时间里，观察到的病变最初不经治疗而消退，后来进展，导致全身性强直阵挛发作。2011年2月行开颅手术，术中涂片细胞学检查，诊断为胶质母细胞瘤。检测结果显示MGMT启动子甲基化，未检测到IDH1/2突变(表1)。
整个治疗过程中各时间点的影像学检查如图1A-G所示。患者从2011年3月开始接受阿法替尼（P.O. 20 mg QD）+放疗（60Gy，30次，超过6周）和替莫唑胺（P.O. 75 mg/m2QD）治疗6周，随后从2011年5月6日开始接受阿法替尼（40mg QD）单药治疗约4周。随后给予阿法替尼（40mg QD）+替莫唑胺（150mg/m2[1个周期]-200mg/m2[2个周期]；从2011年5月31日开始，每个28天周期中的1-5天）。由于3级血小板减少，2个周期后替莫唑胺剂量降低到100mg/m2，并从第3周期到第6周期直到 2011年11月继续服用阿法替尼（40mg QD）+替莫唑胺（100mg/m2；每个28天周期中的第1-5天）。随后，该患者接受了阿法替尼（40mg QD）单药治疗，该治疗方案持续到2017年8月1200.38试验结束后继续使用，作为Named Patient Use program的一部分。
于2012年1月，患者肿瘤缩小≥50%。试验期间患者的最后一次影像学检查(2017年8月)显示，患者显示完全缓解，并在试验后继续服用阿法替尼40mg。该患者于2017年8月终止了试验。截至2020年7月，患者状态良好，并根据当地的神经病科检查结果显示继续完全缓解。
图1
该患者在研究1200.38中发生的大多数不良事件（AEs）强度为1或2级。3级AEs包括癫痫发作、下呼吸道感染和血小板减少，但这些不良事件与研究治疗无关。治疗相关的皮疹和腹泻通过支持治疗得到解决。
病例2（研究1200.38）
患者女性，60岁，有3周语言障碍史，2012年8月被诊断为左顶叶胶质母细胞瘤。在加入1200.38试验时，她有1级语言障碍、偏盲和短期记忆障碍的症状。检测结果显示MGMT启动子甲基化，未检测到IDH1/2突变(表1)。
整个治疗过程中各时间点的影像学检查如图2A-E所示。患者于2012年8月行全切除术，从2012年9月开始接受阿法替尼（30mg QD）加放疗（60Gy/30次，超过6周）和替莫唑胺（75mg/m2 QD）治疗6周，然后从2012年10月开始接受阿法替尼（30mg QD）单药治疗约4周。随后给予阿法替尼（30mg QD）+替莫唑胺（150mg/m2[周期1]；第1-5天），随后给予阿法替尼（40mg QD）+替莫唑胺（200mg/m2[周期2-6]；第1-5天）。从2013年5月开始，患者继续接受阿法替尼单药治疗（40mg QD），直到疾病进展。
于2013年8月患者肿瘤缩小≥50%，维持到2014年7月。总的来说，患者受益于阿法替尼共22个月。复发时，她接受了再切除术，并术后开始洛莫司汀(CCNU)治疗。
图2
在阿法替尼联合替莫唑胺治疗期间患者发生的AEs强度均为1级或2级，主要包括胃肠道和皮肤毒性，以及轻微感染，在某些情况下需要支持治疗（腹泻）或治疗（感染）。
病例3（研究1200.36）
患者3是一位58岁的女性，表现为持续的右侧额部头痛，左侧轻度虚弱，步态障碍和行为改变。2009年10月，她被诊断为多发原发性胶质母细胞瘤。影像学评估显示3个病灶：右侧额叶病变，左侧基底额叶皮层下病变，以及左侧额下回病变。检测结果显示MGMT启动子甲基化，未检测到IDH1/2突变(表1)。
整个治疗过程中各时间点的影像学检查如图3A-G所示。2009年10月手术切除右侧额部病变后，患者于2009年11月10日开始接受一线治疗，包括放射治疗（60 Gy/30次，持续6周）+口服替莫唑胺（75mg/m2 QD），6周后进行替莫唑胺（150-200 mg/m2；每28天周期中的1-5天）辅助治疗。
患者于2010年2月接受3个周期的替莫唑胺辅助治疗后出现疾病进展（左侧额部病变）。2010年4月，患者入组了1200.36研究，在该研究中，接受了阿法替尼（20-40mg QD）联合替莫唑胺（50mg/m2 QD，每28天周期的连续21天）。经过一个疗程的二线治疗后，MRI显示病灶有微小的减小。5个周期后观察到病灶显著消退，并维持约5.5年。
图3
该患者二线治疗期间发生的AEs中，药物相关AEs主要为皮肤毒性和腹泻，通过剂量减少或中断以及标准药物治疗得到有效管理。在整个二线治疗中，患者神经和身体状态稳定（Karnofsky体能状态＞90）。
替莫唑胺在治疗63个周期后于2015年3月停用，患者继续接受阿法替尼单药治疗（20mg QD）10个月（共74个周期），直至2016年1月因皮肤毒性停药。2016年3月，患者病情进展，退出临床试验。MRI显示右额叶肿物较大，强化增强，T2序列信号明显增高，未见明显占位效应。此前检查未见该病灶，提示肿瘤复发和相关假性进展。未发现明显的远处转移或神经系统症状，2016年3月30日随访时患者没有神经系统症状。
2016年4月，患者接受了进一步的手术切除，并收集了肿瘤样本（第二次），随后进行了为期14天的辅助放疗（35Gy/10次）。手术后患者执行功能明显下降，放疗后执行功能恶化。阿法替尼单药治疗（30mg QD）于2016年6月恢复使用，2016年7月至2017年2月，MRI显示疾病控制伴放射性坏死。
到2017年2月，患者认知功能极度受限，几乎卧床不起。于2017年2月初至3月因癫痫住院，住院期间继续服用阿法替尼。最后一次已知的阿法替尼剂量(30mg QD)服用是在2017年3月出院时。最后一次MRI检查于2017年4月，显示右侧额叶病变强化进展。从两个不同部位的右侧额叶增强病灶获得的灌注分析显示低脑血容量(CBV)或CBV值降低。没有显著的质量影响。这些发现与显著的无症状假进展相一致。此外，有证据表明有一个4mm的病变影响髓质后部，提高了继发性肿瘤定位的可能性。该患者在确诊后存活了7.5年左右，于2017年6月因病情恶化死亡。
NGS分析
表1总结了NGS分析的主要结果。这3名患者的肿瘤具有某些共同特征，包括MGMT启动子甲基化，CDKN2A/B缺失，以及TP53、IDH1/2、ErbB2和PDGFRA关键基因未发生突变。患者1和2携带RPTOR基因点突变。患者1和3携带BCOR/BCORL1基因点突变。然而，与患者1不同，患者2和患者3具有复杂的EGFR基因型，表现出局灶性EGFR扩增，同时分别伴有EGFRvIII缺失和D247Y扩增。相比之下，在患者1中未检测到EGFR扩增或突变，关键发现似乎是PTPN11突变。
对于患者3，除了对原发肿瘤进行FoundationOne NGS分析，还对2016年4月进行的二次手术切除的DNA进行了全外显子组测序。分子分析显示，原发肿瘤和继发手术切除的样本在基因上基本相同(表2)。原发肿瘤中发现携带EGFR等位基因EGFRvIII、P596L和G598V的次克隆在二次手术切除的肿瘤组织中未检测到，但原发肿瘤中剩余检测到的等位基因在二次手术切除的肿瘤组织中都能检测到。值得注意的是，与原发肿瘤相比，复发性肿瘤中出现的EGFR基因拷贝较少（20 vs 60）。患者3的第二个样本进行全外显子组测序分析旨在检测可能导致阿法替尼获得性耐药的新基因变异。然而，在该样本中未检测到临床相关性的额外突变。
表2
讨论
对这3名长期对阿法替尼联合替莫唑胺有反应的患者肿瘤样本的NGS分析显示，许多癌症相关基因发生了变异，包括EGFR突变和扩增。虽然这3名患者都携带MGMT启动子甲基化（预后良好因素），但他们也有不利的预后因素（例如未发生IDH突变，以及一例患者携带PTEN缺失），表明这些共同的基因特征并不能解释患者对阿法替尼联合替莫唑胺的良好反应。
患者2和患者3均携带EGFR扩增，并携带EGFR突变，即EGFRvIII突变(患者2)和D247Y点突变(患者3)，这可能是引起反应的基础。EGFRvIII产生于框内缺失，导致截断蛋白的翻译，该截断蛋白缺少部分胞外结构域并具有构成活性。大约50%的EGFR扩增胶质母细胞瘤携带EGFRvIII突变，在没有EGFR扩增的情况下很少发生该突变。虽然EGFR扩增和EGFRvIII突变的预后意义存在争议，但EGFRvIII介导的cMET等受体酪氨酸激酶信号通路的激活可导致肿瘤复发和化疗耐药。值得注意的是，最近的一项临床前研究显示，在体外，阿法替尼和替莫唑胺联合使用可协同抑制EGFRvIII扩增胶质母细胞瘤细胞的增殖、生存和侵袭，并显著降低肿瘤在体内的生长，该发现支持在EGFR扩增和/或EGFRvIII突变的胶质母细胞瘤中评估阿法替尼联合替莫唑胺。在机制上，阿法替尼被证明可以抑制EGFRvIII介导的cMET和Janus激酶/信号传感器和转录激活因子3（JAK2/STAT3）通路的激活，导致替莫唑胺诱导的细胞毒性增强。D247Y突变也影响EGFR的胞外结构域，值得注意的是，临床前证据表明，胞外错义突变可能是致癌性EGFR激活的一种机制，并可能使细胞对EGFR TIKs敏感。因此，总的来说，患者2和3对阿法替尼联合替莫唑胺的敏感性可能是EGFR扩增和EGFRvIII突变或其他细胞外变异引起的。对于患者3，二线阿法替尼之前接受的手术和放疗也可延长无病生存期。
本研究还进行了一项临床前研究，小编在上文没有详细阐述。该临床前研究显示，单药阿法替尼或替莫唑胺均可抑制肿瘤生长，并导致EGFR C端截断。在该模型中观察到的EGFR外显子25-27缺失已知是致癌驱动因素。小鼠使用阿法替尼联合替莫唑胺的试验在该研究中没有进行。然而，其他胶质母细胞瘤临床前模型的试验表明，阿法替尼和替莫唑胺联合治疗可能产生协同作用。
与其他2名患者相比，患者1的肿瘤基因图谱显示出明显的差异，即没有EGFR变异，但发生了PTPN11突变。PTPN11基因编码的SHP2蛋白可调节多种细胞过程，包括致癌转化。功能获得性PTPN11突变通过ERK/CREB通路促进胶质母细胞瘤细胞增殖、转移和肿瘤生长。值得注意的是，SHP2在胶质瘤细胞中具有同时驱动ERK1/2和拮抗STAT3通路的功能，从而影响EGFR/c-MET抑制剂的扩散和耐药。这些SHP2功能在EGFRvIII突变表达足够高的胶质母细胞瘤细胞中被削弱，此外SHP2似乎负向调控这些细胞中的EGFRvIII磷酸化。然而，在患者1中，EGFRvIII为阴性，并且对阿法替尼有反应，这表明PTPN11突变可能通过不依赖于EGFRvIII的机制导致该患者对阿法替尼敏感。
对于患者3，原发性和继发性手术切除的脑肿瘤样本在基因上基本相同，在复发性样本中没有发现可能导致阿法替尼获得性耐药的新基因变异。值得注意的是，一些EGFR等位基因次克隆，包括EGFRvIII，在原发肿瘤中被发现，但在复发性肿瘤样本中却未被检测到，这可能是由于在复发肿瘤样本中进行的外显子组分析检测这些低水平变异的敏感性较低所致。当然，这与在原发性和复发性胶质母细胞瘤中EGFR扩增通常保持不变相一致，但一小部分患者复发后EGFRvIII状态可能改变。
3例患者的AEs均与已知的阿法替尼安全性一致，主要包括皮肤反应和腹泻，未观察到意外的AEs。阿法替尼联合替莫唑胺的安全性也与研究1200.36的主要安全性发现相一致，其中最常见的AEs包括EGFR-TKI相关的腹泻和皮疹/痤疮。与阿法替尼单药治疗NSCLC的临床试验和真实世界的研究一致，药物相关的AEs在3例患者中通过调整剂量和/或支持性治疗得到有效管理，患者可继续使用阿法替尼治疗并长期获益。
综上，这3例胶质母细胞瘤患者携带特定的基因变异（可能导致EGFR成瘾），经阿法替尼治疗获得了显著临床获益。研究结果表明，阿法替尼可能是携带ErbB家族基因变异以及PTPN11突变等其他潜在基因变异胶质母细胞瘤患者的一种有望治疗方法。需要进一步的研究来确定新确诊和复发的胶质母细胞瘤患者受益于阿法替尼治疗的有效生物标志物。
参考文献：
Owen S, Alken S, Alshami J, Guiot MC, Kavan P, Reardon DA, Muanza T, Gibson N, Pemberton K, Solca F, Cseh A, Saran F. Genomic Analysis of Tumors from Patients with Glioblastoma with Long-Term Response to Afatinib. Onco Targets Ther. 2022 Apr 8;15:367-380. doi: 10.2147/OTT.S346725. PMID: 35422631; PMCID: PMC9005142.