在2016年修订的中枢神经系统肿瘤第四版WHO分类中，根据有关髓母细胞瘤生物学、基因组学和临床行为的最新数据对髓母细胞瘤分类进行了调整。首次根据分子特征（“基因学定义”类别）以及组织学特征（“组织学定义”类别）对髓母细胞瘤进行分类。目前基因定义的类别包括WNT激活、TP53野生型SHH激活、TP53突变SHH激活和非WNT/非SHH激活(图1(A))。组织学定义的类型包括典型、结缔组织增生性/结节性（D/N）、间变性/大细胞性（LC/A）和髓母细胞瘤伴广泛结节性（MBEN）。期望每个肿瘤都能从这两种分类中得到诊断，当然这需要一种不同类型的结构化诊断，即在一份诊断报告中同时描述分子和组织学分类以进行分层或综合诊断。本文回顾了髓母细胞瘤分类的最新进展，为这些肿瘤的免疫组织化学和分子检测提供了一种实用的方法，并展示了如何利用关键的分子基因学发现进行综合诊断。
图1（点击图片可放大查看）
综合诊断
尽管在过去的十年中，分子学数据已经成为常规诊断神经病理学的一部分，但如何将现代分子分析的结果（例如，下一代测序，拷贝数，基因表达谱数据）纳入手术病理学报告的范式仍然缺乏。WHO分类系统不要求任何特定类型的报告格式，但国际癌症报告合作组织的指南建议采用模板文本，以获得肿瘤可能的免疫组化或分子特征列表，并标记为存在或不存在。在2016年WHO分类发布之前，建议采用“分层”诊断，且许多中心采用了这一建议。而综合诊断的关键是将分子基因学类别放在诊断报告的最前位置，即使该数据比病理报告的其他数据更晚（即组织学类别或免疫组织化学结果）。报告模型允许对新检测的结果进行替换整合，满足诊断报告所需的灵活性。图1(B)底部展示了髓母细胞瘤的综合诊断示例。
髓母细胞瘤诊断报告应将分子亚群和组织学亚型与任何额外的分子数据（如：相关的基因拷贝数或突变数据）一起报告。对于髓母细胞瘤，可以采用多种多样的检测方法，并将结果纳入综合报告。例如，测序（无论是基于NGS还是Sanger）可检测髓母细胞瘤SHH亚群的TP53突变和潜在的肿瘤易感性胚系突变。CTNNB1突变检测可用于识别大多数WNT激活病例，但这不是必需的。在可行的情况下，进行基因拷贝数分析可以帮助预测。目前，对于髓母细胞瘤综合诊断，预期应包含任何基于组织检测的相关阳性或阴性结果。这具有特殊的临床意义，因为髓母细胞瘤的某些组织学和分子特征与预后相关，如图4所示，下文的相关部分也进行了详细讨论。
必要和合理的诊断标准
2021年WHO分类为每一种肿瘤建立了一套“必要的”和“可取的”诊断标准。对于基因学定义髓母细胞瘤的诊断，信号通路激活（即WNT或SHH）或适当的DNA甲基化分析证据是必不可少的。髓母细胞瘤亚型的合理诊断标准尚未明确。如果肿瘤由于取样不足或组织伪影而不能进行亚型分类，则髓母细胞瘤的诊断不另行规定（NOS）是合适的。
髓母细胞瘤分级
所有髓母细胞瘤根据其不经治疗的预期结果被WHO分为4级。然而，这对于现代治疗方法是否是正确的分类，是否适用于所有髓母细胞瘤亚型仍存在争议。例如，在目前的治疗方案下，WNT亚组髓母细胞瘤患者的生存率超过90%，这表明WHO 4级可能不准确。完全不分级的选择仍然需要病理学家根据潜在的临床结果决定。
基因学定义的髓母细胞瘤亚组
WNT激活型髓母细胞瘤：
根据转录数据，WNT激活髓母细胞瘤被认为起源于脑干背侧的祖细胞。这种亚型在解剖学上靠近脑干，在MRI上有强烈的增强扫描，反映了血脑屏障的通透性。WNT激活髓母细胞瘤约占髓母细胞瘤的10%，大多数发生在年龄较大的儿童和成人(图1(A))。
鉴于WNT激活髓母细胞瘤与其他亚型相比具有不同的临床行为和良好的预后，识别该亚型尤为重要。对于WNT激活髓母细胞瘤患儿，目前治疗的总生存率接近100%。这种生存优势在成人患者中可能不那么明显。WNT激活髓母细胞瘤的一个罕见亚群发生在Turcot综合征背景下，原因是发生了胚系APC突变。这些罕见的肿瘤似乎与其他WNT激活髓母细胞瘤相比有同样良好的预后。
WNT激活髓母细胞瘤必要的基本诊断标准是WNT通路激活，和/或相应的DNA甲基化分析。可以通过β-连环蛋白核免疫反应阳性来建立WNT通路激活的证据(图3(D)和(E))。这种反应可以在整个肿瘤中观察到，但偶尔只出现局灶性核β-连环蛋白免疫反应阳性（建议阈值为3%），因此限制了这种方法的敏感性。
在模棱两可的情况下，正交试验通常是非常有用的，且通过测序可以证明是否发生体系CTNNB1突变，该突变在WNT激活肿瘤中占比>85%。如果进行了CTNNB1突变的分子检测，结果为阴性，那么对于WNT激活髓母细胞瘤患者，应考虑是否可能发生胚系APC突变。6号染色体单倍体如果是唯一的拷贝数变异，也提示WNT激活髓母细胞瘤，在超过80%的病例中存在，即使6号染色体单倍体也可能存在于非WNT肿瘤中。除了核β-连环蛋白免疫反应阳性外，WNT激活肿瘤应表现出YAP1（核和胞质）和丝蛋白A（胞质）免疫组化反应阳性，但不需要GAB1免疫组化反应阳性(图1(B))。在WNT激活肿瘤中，LEF1免疫组化显示清晰、强的核免疫反应性，具有高度的敏感性，这可在β-连环蛋白难以确诊的情况下提供帮助。然而，在SHH髓母细胞瘤中也有不同的LEF1阳性，因此不应对该免疫组化染色结果单独进行分析。
值得注意的是，WNT激活肿瘤中TP53体系突变与较差的预后无关。基于基因表达和DNA甲基化数据的研究描述了WNT激活髓母细胞瘤的亚组，这些亚组的临床意义目前尚不清楚。
SHH激活型髓母细胞瘤：
SHH激活髓母细胞瘤可能源于小脑外部颗粒细胞神经元群。一般来说，SHH激活髓母细胞瘤患者的年龄分布呈双峰型，最常发生在婴儿和成人。SHH激活髓母细胞瘤的分类需根据是否携带致病性TP53突变从而进一步确定。TP53野生型SHH激活髓母细胞瘤通常发生在大一点儿童的小脑外侧部分，在婴儿病例中经常累及蚓部。结节有时可以在X线片上发现，并典型地对应于MBEN组织学。
在SHH激活肿瘤中，癌症易感性综合征尤其重要，20%的病例与胚系致病变异有关。Gorlin综合征（痣样基底细胞癌综合征，与PTCH1胚系突变相关）与SHH亚型的相关性已被长期认可。此外，在SHH激活髓母细胞瘤中观察到胚系SUFU、ELP1和GPR161突变。遗传咨询和胚系分析通常适用于这些肿瘤，特别是对3岁以下的患者和/或有Gorlin综合征临床症状的患者。
在诊断SHH激活髓母细胞瘤方面，SHH通路激活（或相应的DNA甲基化分析）的证据是必不可少的。SHH通路的激活可以通过一组免疫组化染色来证明，包括YAP1（或丝蛋白A）和GAB1，二者均需在SHH激活肿瘤中表达。GAB1和丝蛋白A应显示细胞质免疫反应阳性，YAP1核染色和细胞质染色均应显示阳性。SHH激活髓母细胞瘤中的β-连环蛋白表达应该只显示在细胞质中，而核中没有(图3(F))。另外，RNA表达分析可以用于分子亚组的分类。TP53野生型SHH激活髓母细胞瘤预后不良的关键标志包括MYCN扩增、GLI2扩增、14q染色体丢失和转移性疾病。而MBEN组织学(广泛结节的髓母细胞瘤，详细如下文)与良好的预后相关。
在10-15% SHH激活髓母细胞瘤中存在TP53突变，这些肿瘤应归类为TP53突变SHH激活髓母细胞瘤。与TP53野生型SHH髓母细胞瘤的双峰年龄（好发于婴儿和成人）分布不同，TP53突变SHH激活髓母细胞瘤最常见于儿童或青少年。软脑膜扩散是TP53突变SHH激活髓母细胞瘤的共同特征，经常表现为间变性形态(70%)，或较少表现为结缔组织增生性/结节性伴局灶性间变性。患者预后特别差，需要不同的治疗方法。与其他SHH激活髓母细胞瘤一样，该类肿瘤表现出YAP1（或丝蛋白A）和GAB1的免疫反应阳性，而没有β-连环蛋白核表达。p53蛋白的免疫组化是一种可接受但不是精准的TP53突变状态的替代检测方法，特别是在广泛存在p53强核免疫反应(图3(H))或p53表达完全缺失的情况下。在这些肿瘤中，TP53突变经常(>50%)出现在胚系细胞中（Li-Fraumeni综合征），其余的完全是体系。在TP53区域的17p缺失和杂合性损失是其他相关特征。DNA甲基化和表达分析不能区分TP53突变SHH激活髓母细胞瘤和TP53野生型SHH髓母细胞瘤。
非WNT/非SHH激活型髓母细胞瘤：
不属于上述类别的髓母细胞瘤被指定为“non-WNT/non-SHH”，对应于已确定的分子亚群“group 3”和“group 4”。这一大类占了髓母细胞瘤病例的大多数。虽然在大多数情况下，可以通过DNA甲基化或RNA表达分析来确定组3或组4的分类，但这些亚组之间也看到了一些重叠，最近的附加亚分类表明从组3到组4有一个范围，其中有8个可能的亚型。如下所述，广泛用于髓母细胞瘤亚组的免疫组化染色不能区分组3和组4(图1(B))。甲基化分析和RNA表达分析通常可以将肿瘤分为组3或组4，和/或提供进一步的亚分类。在某些情况下，可能需要区分组3和组4，例如根据两组之间不同的高危分子特征改变治疗方法(图4)。
与在所有髓母细胞瘤中的占比(25%)相比，组3肿瘤在婴儿中的占比过高(40%)。组3肿瘤预后不良指标包括MYC扩增、17q等臂染色体和转移性疾病。组4髓母细胞瘤是最常见的类型（在所有髓母细胞瘤中的占比约35%）。组4肿瘤预后不良的标志包括诊断时患者年龄小（婴儿期）和转移性疾病，预后良好的标志包括11号染色体丢失和17号染色体增加。非WNT/非SHH激活型髓母细胞瘤伴胚系肿瘤易感性的报道很少见，但一般认为二者并没有很强的相关性。
组织学定义的髓母细胞瘤亚组
2021版WHO分类列出了髓母细胞瘤的组织学分类，目的是以分层的方式报告这些分类，并将其分为分子亚组。如果基于分子的亚组信息不可用，且即使通过免疫组化，那么形态学亚组可以独立报道。在分子亚组和形态学亚组都不能评估的情况下，可以使用NOS。
大多数髓母细胞瘤具有典型的形态学特征（图2(A)至(C)），以所谓的“小圆蓝细胞”外观为特征，易于识别有丝分裂图像和凋亡小体，缺乏其他形态学类别的典型特征（即网状蛋白浸润结节和细胞学间变性）。只有少数典型的髓母细胞瘤含有发育良好的Homer Wright玫瑰花结（见图1(B)，例如非WNT/非SHH H＆E）。
图2（点击图片可放大查看）
促结缔组织增生型/结节型(D/N)髓母细胞瘤表现为中度细胞性肿瘤的结节区，被密集细胞区和细胞间网蛋白包围，呈现包被样外观(图2(F))。网织蛋白染色是识别这种亚型的关键，结节间区Ki-67标志物升高也支持该诊断。需要注意的是，任何髓母细胞瘤累及蛛网膜下腔都可能导致粘连增生(图2(D))，在确定这一组织学类别之前，应注意鉴别明确的结节(含苍白岛(pale islands)：含有圆形规则核和丰富细胞质的细胞(图2(E)至(G))。具有广泛结节的髓母细胞瘤(MBEN)也具有结节结构(图2(H))，但应表现为包含更多分化肿瘤细胞的更大结节(图2(I))。这种亚型是最罕见的组织学类型，在所有髓母细胞瘤中占比不到5%。D/N和MBEN亚型在3岁以下的患者中更为常见（D/N占比约50%，MBEN占比约20%），并且在较小年龄儿童中与极好的预后相关。两者在很大程度上都局限于SHH激活型。需要SHH通路激活的证据才能正式将其列为该诊断类别，因为其他分子亚群中偶尔也会出现结节。
具有大细胞/间变(LC/A)形态的髓母细胞瘤是由带有显著核仁的大细胞外观(图3(C))和/或由细胞核增大、明显的多形性和细胞-细胞包裹构成的细胞学间变(图3(A)和(B))定义的。对Pediatric Oncology Group中髓母细胞瘤的回顾性分析显示，中度和重度发育不全是预后较差的因素，发育不全的程度也是影响预后的重要因素。在大多数的肿瘤标本中应存在间变性形态，高核分裂指数和凋亡指数是这一类型的典型特征。该肿瘤亚型在诊断时通常表现为转移性疾病(60-70%)，容易复发和脑脊液扩散。LC/A髓母细胞瘤的5年无进展生存率为30-40%。值得注意的是，具有显著核仁的大细胞外观高度提示MYC或MYCN扩增，应提示进行FISH检测或拷贝数分析。
图3（点击图片可放大查看）
髓母细胞瘤诊断和报告的实用方法
当遇到小儿后颅窝胚胎性肿瘤时，髓母细胞瘤是首要考虑的。应对SMARCB1/INI1（和罕见的SMARCA4/BRG1）进行常规免疫组化以排除不典型畸胎样/横纹肌样肿瘤(AT/RT)的可能性，尤其是对于3岁以下的患者。SMARCB1/INI1应在髓母细胞瘤细胞核内表达，在AT/RT中的免疫反应性特异性丧失，反映SMARCB1失活。另一个需要考虑的问题是具有多层玫瑰花结的胚胎肿瘤（ETMR），尤其是在幼儿中，该类型肿瘤通常显示LIN28A的免疫反应性。ETMR诊断的其他依据是广泛富含神经胶质区域和小管腔周围多层的肿瘤细胞玫瑰花结。
一旦确诊为髓母细胞瘤，免疫组化panel可以帮助亚分组包括GAB1、YAP1、丝蛋白A和β-连环蛋白。网织蛋白染色有助于突出结缔组织区域，并有助于评估肿瘤结节的存在和范围(真结节应近周被网织蛋白包围，图3(G)。Ki-67可能有助于突出肿瘤的增生性区域，如D/N髓母细胞瘤的结节间区域，或LC/A肿瘤的发育不全程度。使用免疫染色panel应允许分层或综合诊断，包括组织学定义和基因学定义的类别(见图1(B)中的示例)。建议进行额外的检测，以确定具有重要预后意义的分子基因特征。这一辅助检测类别中常用的分析方法是检测MYC（8q24.21）和MYCN（2p24.3）的FISH，以及检测CTTNB1和TP53的单基因测序。NGS panel通常具有提供包括其他相关癌症基因的优势，如SHH通路中的基因，这可能有助于识别潜在的胚系病例，而拷贝数分析可能与髓母细胞瘤的预测相关性更大。如果可行的话，DNA甲基化分析或基于RNA表达的分析可用于分型，这两种技术均可用福尔马林固定的石蜡包埋样本。DNA拷贝数评估可以通过大量的检测来进行，这不仅有助于检测MYC/MYCN扩增，还有助于检测6 号染色体单体型（WNT激活型）和17q等臂染色体、11号染色体丢失、GLI2扩增和17号染色体增加(非WNT/非SHH激活型)。
最终，整合组织学和分子学诊断的目的是综合肿瘤所有相关得预后信息。在如今髓母细胞瘤实践中，这种预后信息可能会以基因扩增、功能缺失突变或组织学特征（如发育不全）的形式出现，因此简明而完整的报告是绝对必要的。临床表现最差的髓母细胞瘤类型为MYC扩增组3肿瘤、TP53突变和/或MYCN扩增或GLI2扩增SHH激活LC/A肿瘤。髓母细胞瘤预后标志物的分类如图4。
图4（点击图片可放大查看）
最后，对于部分病例，推荐胚系检测是病理报告的重要组成部分。癌症易感性是儿童期癌症（包括髓母细胞瘤）的一个重要因素(图4)。对于被诊断为WNT激活髓母细胞瘤但不携带CTNNB1 3号外显子突变的儿童，可以建议进行APC测序。SHH激活肿瘤通常与胚系突变有关，包括SUFU、PTCH1、TP53、PALB2和BRCA2。在罕见病例中，非WNT/非SHH激活型肿瘤可能与PALB2或BRCA2突变相关，这些患者很可能有明显的癌症家族史。事实上，对于那些p53免疫组化阳性的SHH激活髓母细胞瘤患者、3岁以下的SHH激活髓母细胞瘤患者，或者任何具有明显肿瘤家族史的癌症患者，都应该考虑进行胚系检测。
髓母细胞瘤诊断分子检测的作用
世界各地的病理学家在使用下一代测序、SNP阵列、甲基化阵列等检测平台方面存在差异，这使得WHO不愿对使用哪种类型的检测平台来诊断髓母细胞瘤进行规定。虽然新的检测平台可以对髓母细胞瘤肿瘤生物学有更深入的了解，但儿科肿瘤医生可操作的大多数诊断信息仍然可以通过光镜分析和有限的辅助研究（如免疫组化和FISH）来获得。一些研究中心可能会选择将所有髓母细胞瘤进行分子检测，而其他研究小组可能会选择只在经免疫组化评估的特定病例中进行特定的分子研究。
2021年第5版WHO分类尚未对可能存在于非WNT /非SHH激活型类别中的亚组确定足够的临床意义。临床试验目前正在开始，因此确定髓母细胞瘤患儿亚型（组3与组4）之间的差异将是很重要的，甲基化阵列和RNA表达分析都可提供有用的信息。考虑到亚组之间的差异，选择合适的辅助检查可能会令人困惑，因此图4总结了癌症易感性的关键预后生物标志物和指标。该医疗中心对髓母细胞瘤的当前治疗方法总结如图5。
图5（点击图片可放大查看）
临床上重要的髓母细胞瘤亚组的划分在未来几年可能会继续发展，但执业病理学家的总体方法将保持不变。目的是提供一个分层的、综合的诊断，包括相关的组织学和分子基因学特征（包括提示胚系肿瘤易感性综合征的变异），以实现准确的诊断并为患者的最佳护理提供相关的预后信息。
参考文献：
Cotter JA, Hawkins C. Medulloblastoma: WHO 2021 and Beyond. Pediatr Dev Pathol. 2022 Jan-Feb;25(1):23-33. doi: 10.1177/10935266211018931. PMID: 35168417.