微卫星不稳定性（MSI）是预测免疫检查点抑制剂疗效的关键指标，然而只有1-2%的胆道癌患者具有这一特征。研究人员对1例肝门胆道癌患者的两份肿瘤组织标本（胆管狭窄处的钳夹活检术样本，和邻近淋巴结的超声内镜引导下细针穿刺活检术[EUS-FNAB]样本）进行了MSI检查，在两份样本中观察到不一致的结果——因为高度微卫星不稳定性（MSI-H）只在钳夹活检的样本中被发现。虽然FNAB样本比钳夹活检的样本大10倍，但肿瘤细胞含量要低得多，这可能是一个导致MSI结果不一致的原因。此外，四种错配修复（MMR）蛋白的免疫组化显示为pMMR。该肿瘤对吉西他滨、顺铂和S-1耐药，但对帕博利珠单抗应答良好。这表明需要谨慎选择样本和解读检测结果，以免错过获得有效分子靶向药物的机会。
背 景
微卫星不稳定性（MSI）是筛查Lynch综合征和预测免疫检查点抑制剂疗效的关键指标。如今，MSI可作为晚期实体瘤患者对帕博利珠单抗的伴随诊断（CDx），并被纳入肿瘤精准医疗的多基因组检测（MGPT）中。在日本，胆道癌（BTC）患者的数量不断增加，2019年时达到2.2万人以上。这些患者的总体5年总生存率为24.5%，不可切除患者的中位总生存期为14个月。虽然MSI-H在BTC中较为少见，仅出现在0.9-1.6%的患者中，但对应的分子靶向药物帕博利珠单抗对晚期BTC有显著疗效（总缓解率为40.9%，总生存期为24.3个月）。本文报道了1例肝门BTC患者，其原发部位的钳夹活检样本显示MSI-H，而邻近淋巴结的超声内镜引导下细针穿刺活检（EUS-FNAB）样本显示微卫星稳定（MSS）。患者接受了帕博利珠单抗单药治疗，反应良好。
病 例
患者男，43岁，既往有腮腺良性肿瘤手术成功治疗史，但无恶性肿瘤史。患者外祖父在50多岁时罹患癌症（无原发部位的信息），表姐在40多岁时罹患结直肠癌。患者因右侧季肋部疼痛，到当地医院就诊，诊断为肝门胆管狭窄和肝内胆管扩张。未见发热或黄疸。因疑似肝部BTC而被转至日本静冈癌症中心。患者血液检查显示，血清肝胆酶水平升高（GOT：147 U/L[正常范围：10-40 U/L]，GPT：311 U/L [5-40 U/L]，ALP：601 U/L [38-113 U/L]，GTP：995 U/L[≤70 U/L]），血清肿瘤标志物轻度上调（CEA：1.3 ng/mL[≤5.0 U/L]，CA19-9：41 U/mL[≤37 U/L]）（表1）。
表1 实验室数据
增强CT显示肝门胆管及脐部有直径25mm的肿块，肝门周围淋巴结不规则肿大（图1a，b）。鉴于淋巴结转移已扩散至肝总动脉和腹腔动脉周围，临床医生判断不可手术。超声内镜引导下的细针穿刺活检术样本（EUS-FNAB，图2a）显示小的腺癌碎片散布在大量白细胞、红细胞和纤维组织内（图2b，c）。内镜下逆行胆管造影证实肝门胆管狭窄（图3a）。在胆管狭窄部位进行了四次钳夹活检（图3b），结果显示存在多簇腺癌组织（图3c，d）。钳夹活检样本的免疫组化（IHC）显示，错配修复（MMR）蛋白表达正常（MLH1，MSH2，MSH6和PMS2）。
图1 患者CT检查结果
图2 超声内镜引导下细针穿刺活检（EUS-FNAB）
图3 胆管钳夹活检
患者接受吉西他滨、顺铂和S-1的全身化疗，缓解持续4个月，但在第7个月时淋巴结肿大复发（图1c，f）。经患者同意，进行了MSI的CDx和MGPT检测。由于FNAB或钳夹活检样本的组织量不足以进行两项检测，因此将FNAB样本分配进行MSI检测，将钳夹活检样本分配进行MGPT检测。MSI检测显示MSS（5个位点均未改变）（图2e）。然而MGPT结果显示了多个基因变异，包括MSI-H和高肿瘤突变负荷（TMB-H） （10.09Muts/Mb；TMB-H≥10Muts/Mb），提示免疫检查点抑制剂有效。患者随后开始接受帕博利珠单抗单药治疗（200mg / 3周），在开始治疗2个月后缓解（图1d，g），并在继续接受2个月治疗后出现进一步缓解（图1e，h）。患者及其家人接受了Lynch综合征可能性的遗传咨询。向患者介绍了Lynch综合征的概念和MMR基因的胚系检测的必要性，但患者拒绝接受检测。
为了确定MSI结果不一致的原因，在显微镜下计算肿瘤细胞含量并测定样本量。首先，获取苏木精-伊红（HE）染色切片的镜下图，可视为用于DNA提取的切片。再应用图像分析软件测量组织总面积。在FNAB和钳夹活检样本中，测量6个最明显的放大区域（× 100）以确定肿瘤细胞含量，每个区域由>1000个核阳性细胞组成。通过软件计算核阳性细胞数量，研究人员目测计算肿瘤细胞数量。FNAB总样本面积为83.8 mm²，钳夹活检样本面积为6.9 mm²。FNAB样本的肿瘤细胞含量为0.8%，而钳夹活检样本的肿瘤细胞含量为13.9%。
讨 论
标准化疗对晚期BTC的疗效有限，基于CDx和MGPT的精准医疗开启了新的治疗格局。在BTC的精准医疗中，MSI-H是最有前景的分子标志物，因为帕博利珠单抗显示出显著的缓解率（40.9%）和总生存期的延长（24.3个月）。尽管本文BTC患者对标准化疗耐药，但对帕博利珠单抗表现出良好的应答（图1c-h）。个体化精准医疗需要高度的准确性和一致性，但本文病例的MSI检测和MMR IHC存在不一致的问题。
一般来说，MSI检测分为两种方法：聚合酶链反应（PCR）扩增+毛细管电泳法和下一代测序（NGS）检测法。这两种方法都分析了高度敏感的微卫星位点，尽管分析的位点在NGS检测中是保密的。即使在分析相同的肿瘤样本时，MSI的敏感性也会根据MSI标志物的选择而略有不同；NGS可以检测Promega标志物、Idylla标志物等原始标志物。但由于PCR法（约10%）和NGS法（8.3-15.8%）的灵敏度相似，因此本病例中不一致的MSI结果应该样本来源不同导致的。
使用不同肿瘤细胞含量占比的样本（钳夹活检13.9%，FNAB 0.8%）可能会影响MSI结果，因为钳夹活检样本（图3c，d）为MSI-H， FNAB样本（图2b，c）为MSS。此外，FNAB组织样本比钳夹活检样本大10倍以上，但FNAB样本主要由纤维组织、白细胞和红细胞组成。EUS-FNAB已被用于诊断淋巴结转移，甚至可以评估临床分期和手术指征。由于淋巴结FNAB组织中肿瘤细胞含量低，虽然可用于进行病理诊断，但可能不是进行分子检测的最佳样本（肿瘤细胞含量占比远低于10%）。对肿瘤组织进行显微解剖可作为提高肿瘤DNA浓度的方法。同时，对位于肝门胆管远端的BTC，钳夹活检被认为是一种有效的方法。临床医师需要小心罕见的不良事件，如出血和穿孔。
研究人员还测定了钳夹活检样本中MMR蛋白的IHC，但评估结果与MSI结果相矛盾，因为MMR蛋白表达正常。BTC中MMR蛋白表达缺失（dMMR）的发生率很低（0.9-4.3%），与MSI-H相似。研究人员在一些BTC病例中分析了MSI和MMR IHC的一致性，结果显示：胰胆癌的一致性水平（87.5%，28/32）显著低于胃肠道肿瘤（99.3%，345 /438）（P = 0.001）。Ando等人分析了四例dMMR BTC患者的MSI，其中两例患者为MSS（均为dPMS2肿瘤）。由于BTC活检样本中肿瘤数量较少，且存在非肿瘤细胞的“污染”的问题，因此如果用MMR IHC代表整个肿瘤，有时很难准确评估。此外，不同病理医师对MMR IHC的评估可能不一致，特别是在异质表达的情况下。由于在晚期BTC病例中可采用的方案有限，并且大多数用于CDx或MGPT的样本都是活检组织，因此在评估MMR缺陷或MSI-H时需要谨慎。
总之，在BTC患者中，ICI的适用范围是有限的，但在MSI-H患者中，ICI的显著效果是可以预测的。对于未手术的BTC患者，MSI可能是肿瘤精准医学或CDx的指征，临床医生应努力在采样时获得足够数量和含量的肿瘤细胞，并且需要牢记MMR表达与MSI状态之间可能存在不一致，特别是在使用小活检样本检测时。
参考文献：
Matsubayashi H, Todaka A, Ishiwatari H, Sato J, Niiya F, Kondo T, Ono H, Yamazaki K, Sasaki K, Kiyozumi Y. Discordant microsatellite instability findings in two samples from a patient with biliary cancer that responded to pembrolizumab. Clin J Gastroenterol. 2023 Jul 25. doi: 10.1007/s12328-023-01833-7. Epub ahead of print. PMID: 37490248.