低级别阑尾黏液性肿瘤有哪些分子特征？和黏液性腺癌竟是同一疾病的不同阶段？

3.WHO组织学分级：世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将大部分非侵袭性的上皮源性肿瘤命名为低级别阑尾黏液肿瘤（low-grade appendiceal mucinous neoplasms，LAMNs），其本质是一类组织学上分化良好的腺瘤，但是却能以恶性肿瘤的生长方式在阑尾外增殖，造成阑尾外黏液聚集。这些黏液可以以细胞结构形式存在或非细胞结构形式存在。这些阑尾肿瘤具有潜在恶性的生物学行为，例如会造成阑尾穿孔、阑尾壁的纤维化、阑尾壁黏液形成以及阑尾周围软组织内非细胞结构黏液聚集。高级别阑尾黏液肿瘤（high-grade appendiceal mucinous neoplasms，HAMNs）相比较LAMNs表现为具有更强侵袭性的细胞异型。

《中国阑尾肿瘤多学科综合治疗专家共识（2021版）》指出，阑尾肿瘤会导致阑尾穿孔和腹腔播散，当腹腔播散灶产生大量黏液时则被定义为腹膜假性黏液瘤（pseudomyxomaperitonei，PMP）。由于PMP在治疗后容易复发且术后10年总生存期约为63%，因此专家组建议将PMP定义为一种恶性疾病。PMP黏液中细胞数目与患者的预后密切相关，因此专家组建议可以将其分为无细胞型、腹膜低级别黏液癌（low-grade mucinous carcinoma peritonei，DPAM）、腹膜高级别黏液癌（high-grade mucinous carcinoma peritonei，PMCA）、存在印戒细胞的腹膜高级别黏液癌（high-grade mucinous carcinoma peritonei with signet rings cells，PMCA-S）。共识详情请移步往期推文：中国阑尾肿瘤多学科综合治疗专家共识（2021版）-附下载

虽然一些研究表明，PCI<20且术后无肿瘤（CC-0）的患者OS有所改善，但也有一些例外。例如，考虑到CRS后通常可以转换为CC-0评分，高PCI对LAMN患者的意义较小。相反，低PCI并不意味着特定的组织学分级和手术部位的肿瘤细胞完全减少，例如上腹部黏液性印戒细胞癌。CC评分对外科医生的价值也有限，因为在未进行CRS/HIPEC之前是不可用的。术前，外科医生必须合理地预测肿瘤细胞完全减少的可能性，以避免使患者受到不必要的伤害。

AJCC/世界卫生组织播散性AMN的组织学分级已成为患者预后和管理的关键协变量。LAMN患者的中位 5 年OS率为 79-86%，而在黏液性印戒细胞癌患者中下降到 22-27% 。此外，组织学分级可以帮助对播散性AMN患者进行分层治疗。在一项大型回顾性分析中，中度和低分化的黏液腺癌患者以及同时接受系统性辅助化疗的患者与未接受系统性化疗的患者相比，OS有所改善；然而，LAMN患者没有观察到对系统性化疗的显著获益。尽管已经制定了一致的标准，但AMNs的组织学分级仍然是病理医师困惑的源头，也是一个存在重大分歧的领域。因此，需要客观的生物标志物来准确预测播散性AMN，并对患者进行分层以进行后续治疗。

最近，对播散性AMNs的全面基因组分析已经确定了在不同组织学分级中普遍存在的基因变异。KRAS和/或GNAS的突变经常出现在LAMN和分化较差的黏液腺癌中。相比之下，TP53突变在LAMN中并不常见，但多见于分化程度较差的黏液腺癌中。然而，目前尚不清楚分子检测是否有助于对伴有播散性疾病的AMN患者的临床结果进行分层，因为大多数研究的患者数量有限。此外，考虑到这些肿瘤中的肿瘤细胞数量少，许多下一代测序（NGS）研究报告表示在播散性AMN患者中缺乏可检测到的基因变异，这种情况较为常见。因此，本研究的目的是：（1）使用高覆盖深度的独特敏感靶向NGS测定大患者队列，评估播散性AMN中基因变异流行率；（2） 将已鉴定的基因变异与各种临床病理特征相关联，包括PCI、CC评分和组织学分级；（3）确定上述基因变异与其它预后因素的关系，以及临床意义。

研究设计

研究人员回顾了匹兹堡大学医学中心（UPMC）1998-2021 年间的外科病理学档案，以寻找有可用HE染色切片和至少一个福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）和/或相应的未染色切片的播散性AMN患者（PMP）。如果唯一可用的组织石蜡块来自原发性阑尾肿瘤，则该病例被排除在本研究之外。换句话说，基因检测和分析仅限于播散性患者，不包含原发阑尾疾病的患者。此后，将病例与患者的电子病历进行交叉引用，以确保有至少 6 个月的详细临床病史和OS数据。对于所有病例，至少由两名病理学家对HE染色切片进行审查，以确定是否存在黏液性肿瘤，并排除其它实体瘤，如杯状细胞腺癌。此外，任何单独进行组织病理学会诊的病例（不包括临床/手术评估），都被排除在外。根据第 8 版AJCC分期手册和 2019 年世卫组织消化系统肿瘤分类，对每个病例进行组织学分级。总共鉴定出 183 名患有播散性疾病的AMN患者。淋巴血管侵袭、神经侵袭和区域淋巴结转移的存在是根据可用的病理切片，或从患者的病理报告中确认的。除了病理结果外，还从相应的临床记录和手术记录中获得了人口统计学数据（性别和年龄）、PCI和CC评分。

研究人员通过对手术FFPE标本进行靶向NGS检测，以评估以下胃肠道癌症相关热点基因突变状态：AKT1、ALK、ATM、BRAF、CDKN2A、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53和VHL。研究人员根据 2017 年分子病理学协会/美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会（AMP/ASCO/CAP）制定的指南，对每种变异进行了排序。报告了I级、II级和III级变异，但只有I级和II级变异用于后续分析。该检测方法的检测极限为 3-5% 的变异等位基因频率。检测的最低覆盖深度为1000×。

研究结果

播散性阑尾黏液性肿瘤（AMN）研究队列

研究人群包含 183 名患者，年龄 27-87 岁（平均 58.1 岁；中位 57.0 岁），女性较多（103/183，56%）。根据AJCC和 2019 年WHO第 8 版标准，播散性AMN（PMP）组织学分级如下：82 例（45%）1级，66 例（36%）2级，35 例（19%）3级（图1）。淋巴血管侵犯和周边神经侵犯分别为 36 例（20%）和 22 例（12%）。此外，31 例（18%）患者被发现有局部淋巴结转移。根据术中评价，PCI评分范围在 1-39 之间（平均 22.2，中位 23.0）。对 183 例患者而言，进行手术目的是为了实现肿瘤细胞的完全减少；其中，167 例（91%）患者进行了CRS，157 例（86%）患者进行了HIPEC治疗。CRS结束时，CC评分为：111 例（66%）CC-0，40 例（24%）CC-1，16 例（10%）CC-2。所有 183 例患者的随访时间为 3 个月至 23 年（平均 3.7 年，中位 2.8 年）。5 年的OS率为 77%，10 年OS率为 62%。

图1 队列中播散性AMN分类

A-C 肿瘤学分类1级，特点是丰富的黏液池，黏液上皮稀少，细胞核伴有轻度异常

D-F 肿瘤学分类2级，表现出破坏性侵袭，肿瘤细胞与粘蛋白比例升高，相关结缔组织增生，细胞核异形程度更高

G-I 肿瘤学分类3级或分化程度较差的腺癌，由＞10%的印戒细胞组成

播散性AMN的靶向NGS检测

图2 183例播散性AMN患者及相关PCI、CC评分、AJCC/WHO分级和靶向NGS结果图

靶向NGS检出肿瘤细胞基因变异的患者有 179 例（98%）（图2），肿瘤细胞含量为 10%-80%（中位 25%）。其中 13 个热点突变频率从高到低依次为：GNAS（59%）、TP53（24%）、SMAD4（19%）、PIK3CA（4%）、ATM（4%）、PTEN（2%）、NRAS（2%）、BRAF（2%）和CDKN2A（1%）。160 例（87%）患者存在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路突变，包括KRAS、NRAS和BRAF。此外，8 例（4%）GNAS突变的肿瘤未发生MAPK通路变异。总的来说，在 168 例（92%）播散性性肿瘤中发现MAPK/GNAS改变，这些基因变异与年轻的平均年龄、低AJCC/WHO分级、淋巴血管浸润、神经周浸润和区域淋巴结转移相关（p< 0.030），如表1所示。相比之下，78 例（43%）患者的TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因（PIK3CA和PTEN）均发生了变异。如表2所示，这些基因的共突变（任何一种基因的改变）与较大的平均年龄、较高的AJCC/WHO分级、存在淋巴血管、神经周浸润和区域淋巴结转移，以及较低的平均PCI（p< 0.040）相关。另外，研究人员还对患者的CC评分进行了单独分析，以确定CC-0/1和CC-2肿瘤患者之间的临床病理和基因组差异。CC-2患者更有可能有更高的平均PCI评分，而接受HIPEC治疗的可能性更低（p<0.001）。此外，mTOR基因（PIK3CA和PTEN）变异在CC-2肿瘤患者中更为常见（p=0.002）。

表1 183例播散性阑尾黏液性肿瘤（腹膜假性黏液瘤）的临床和病理特征：MAPK基因和/或GNAS的突变

表2 183例播散性阑尾黏液性肿瘤（腹膜假性黏液瘤）的临床病理特征：TP53、SMAD4、CDKN2A、ATM和mTOR基因变异

在一些研究中，AMN的组织学分级已获证是一个预后因素。与先前的报告一致，随着AJCC/WHO分级的增加，术后 3 年、6 年和 9 年的OS率呈缩短趋势：AJCC/WHO组织学分类为1级患者的5年OS率为 93%，10年为 83% ；AJCC/WHO组织学分类为2级的患者5年OS率为 71%，10年为 17%；AJCC/WHO组织学分类为3级的患者5年OS率为 39%（p<0.001）（图3A）。同样，CC评分的增加对于OS率也具有统计学意义：CC-0的5年OS率为 88%，10年OS率为 70%；CC-1的5年OS率为 74%，10年OS率为 56%；CC-2的5年OS率为 61%，10年OS率为 46%（p<0.001)（图3B）。在靶向NGS结果中，确定了KRAS、TP53、PTEN和CDKN2A的状态与OS具有统计学意义的关系（p<0.006）。而TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和/或mTOR基因的状态也是预后因素。没有这些基因变异的5年和10年OS率均为 88%，存在这些基因变异的5年OS率为 55%，10年OS率为 14%（p＜0.001）（图3C）。

图3 播散性AMN患者OS的KM曲线

A AJCC/WHO组织学分级；B CC评分；C 有无基因变异

基于CC评分评估的OS率显示，CC-0/1肿瘤患者在没有MAPK/GNAS变异的情况下OS较差（p < 0.001）。相比之下，CC-2肿瘤患者在mTOR基因变异（PIK3CA和PTEN）的情况下，OS率较低（p = 0.002）。基于CC评分评估OS时，没有其它基因变异与患者OS差异相关。

表3 183例播散性阑尾黏液性肿瘤（腹膜假性黏液性瘤）患者的总生存期的单因素和多因素Cox回归分析

表3 总结了与包括NGS结果在内的各种临床病理特征相关的单变量和多变量Cox回归分析。在单变量分析中，较短的OS与年龄、较高的AJCC分级、淋巴血管浸润、周围神经浸润、区域淋巴结转移、较高的PCI、无法进行CRS、缺少HIPEC治疗、通过CC评分评估残留病灶的数量，以及TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和/或mTOR基因变异相关（p<0.016）。

此外，在包括AJCC/WHO分级、PCI、HIPEC治疗、CC评分、TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因状态的多变量模型中，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和/或mTOR基因变异是OS的独立预后因素（p = 0.006）。

讨 论

与之前的研究一致，播散性AMN（PMP）中最普遍的基因变异涉及MAPK信号通路和GNAS。MAPK/GNAS突变在 92% 的病例中存在，在所有三种AJCC/WHO组织学分级中均有发现。相比之下，在 43% 的播散性AMNs中发现了TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因变异，并优先在中度分化和分化较差的黏液腺癌中发现。此外，这些基因的突变在临床上与患者OS降低有关，但OS降低与AJCC/WHO分级、PCI和CC评分无关。到目前为止，评估播散性AMN基因图谱及其预后意义的报告数量有限。Ang等人的研究（最大阑尾肿瘤研究之一）与本文报道的结果类似，作者发现MAPK/GNAS突变是播散性AMN中最常见的基因变异，而TP53和SMAD4的失活在黏液腺癌和印戒细胞癌中被优先被检测到。虽然进行预后随访的患者数量较少，但Ang等人的研究结果显示TP53突变与患者OS的降低相关。同样，Raghav等人发表的研究表示，TP53突变在中度分化和分化不良的黏液腺癌中富集，TP53突变状态与CRS/HIPEC后较差的OS相关。然而，在调整AJCC/WHO分级后，TP53的突变并不是OS的独立预后因素。值得注意的是，在Raghav等人的研究中，基因变异患者的患病率为 85% 。此外，MAPK基因和GNAS基因的突变率分别为 59% 和 28% 。相比之下，本文作者使用NGS Panel进行深度测序，发现 98% 的播散性AMN患者发生基因变异，分别有 87% 和 59% 的患者存在MAPK基因和GNAS突变，因此可以解释先前研究和本文结果之间的差异。然而，Raghav等人假设，播散性AMN不是由单个优势基因引起的，而是多个基因通路的失调引起的。这一假设得到了本文结论的支持，即不仅涉及TP53，还涉及SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因。

尽管在播散性AMN中存在基因异质性，但从靶向NGS的结果中可以推断出一个潜在的肿瘤进展模型。基于胃肠道肿瘤通过累积基因变异并线性发展的原则，MAPK基因和/或GNAS的突变代表了播散性AMN中最早的基因事件，如前所述，在LAMN和黏液腺癌中均有检测到。晚期基因变异特点包括TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因，主要在黏液腺癌中被发现。因此，本文数据表明，阑尾黏液性腺癌起源于LAMN。当考虑到其他具有类似基因变异的肿瘤，如由导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMNs）引起的胰腺导管腺癌（PDACs）时，这种潜在的模型也有一定的根据。

除了LAMN，低级别发育不良的IPMN经常发生MAPK基因和GNAS突变，并获得TP53、SMAD4、CDKN2A和mTOR基因变异，因为它们会过渡到高级别发育不良IPMN/PDAC，类似阑尾黏液腺癌。有趣的是，许多TP53和mTOR基因的获得性变异获证发生在高级别发育不良/PDAC之前。相比之下，LAMN中也存在TP53、SMAD4、ATM和mTOR基因的改变。对于患有低级别发育不良的LAMN和IPMN，在组织学上的低级别肿瘤中发现这些“晚期”突变表明肿瘤转化的风险增加，可能需要密切的监测和/或更积极的管理。因此，本文的研究结果进一步强调了将靶向NGS纳入评估播散性AMN的临床效用。

研究作者表示该研究存在局限性。这是一项回顾性研究，并不是所有患者均接受了相同形式的HIPEC或系统性化疗方案。此外，通过靶向NGS评估的基因数量相对较少。播散性AMN是具有丰富黏蛋白背景下的少细胞肿瘤，这对目前的NGS测序而言是一个重大的挑战。本研究的另一个局限性是，研究人员评估了患者首次诊断为播散性疾病时的组织标本，因此在长期随访中，它不能充分评估多轮连续治疗后播散性AMN的基因变化情况。最后，研究人员注意到一部分分化不良的黏液腺癌MAPK/GNAS突变阴性，这与提出的LAMN进展为黏液腺癌相反。然而，AJCC/WHO组织学分类3级的肿瘤病理评估面临的挑战之一是在分化不良的阑尾黏液腺癌和杯状细胞腺癌之间进行鉴别。仅根据病理学评估，低分化阑尾黏液腺癌，如黏液印戒细胞癌，在组织学上可能与杯状细胞腺癌难以区分。考虑到杯状细胞腺癌中通常不存在MAPK/GNAS突变，因此，本研究中可能无意中纳入了一小部分杯状细胞腺癌，其类似于阑尾分化不良的黏液腺癌，从而解释了这种差异。

结 论

总之，针对播散性AMN（PMP）的靶向NGS发现MAPK/GNAS具有较高的突变率，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因的突变频率较低。然而，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因变异与黏液腺癌、淋巴管和神经束侵犯，以及患者较差的OS有关。此外，这些“晚期”突变是OS的不良预后因素，与AJCC/WHO分级、PCI和CC评分无关。虽然需要集中研究以进一步阐明播散性AMN的遗传机制及其在初始治疗后随时间推移的肿瘤进展，但本文的分子研究结果表明，从LAMN到黏液腺癌的线性进展模式，其过渡特征为多种基因通路的失调。

同刊专家点评

同刊的其他专家基于本文内容和相关领域研究进展，对本文进行了点评。虽然高级别阑尾癌的治疗方法通常与结肠癌类似，但需要明确这两种肿瘤是不同类型的实体瘤，它们具有不同的致癌驱动因素和体系突变频谱。而且，在一些患者的肿瘤中发现高级别和低级别成分共存；一些重复进行细胞减灭术和腹腔热灌注化疗（CRS/HIPEC）的低级别患者，在最终病理检查时也会发现低级别和高级别成分共存，这样的情况较为常见。在同一患者不同病变的体外类器官培养研究中也观察到了相似的异质性。

阑尾癌的基因图谱

Wald等人（本文作者）展示了 183 名初诊为低级别阑尾肿瘤患者的测序数据。他们的发现为上述临床观察提供了进一步的支持，表明低级别阑尾黏液性肿瘤（LAMN）和黏液性腺癌可能是同一疾病的不同阶段，类似胰腺导管内乳头状黏液瘤（IPMN）进展为腺癌。

研究结果表明，在 183 例患者中，共有 179 例（98%）检出了播散性AMN相关的基因变异。在与胃肠道恶性肿瘤有关的 28 个已知基因中，KRAS和GNAS突变最频繁，并且具有突变共现（mutational co-occurrence）的趋势，这一发现与先前的报道一致。也有观察到其它基因发生重复突变，包括TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A、PIK3CA和PTEN，但频率较低。

该研究作者根据他们的发现提出了一个遗传进展模型。基于该模型，疾病进展的早期基因变异涉及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）基因和/或GNAS的突变。这些突变在LAMN和黏液腺癌中均被检测到。另一方面，晚期患者的基因变异特点是TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和TOR基因突变，这些基因主要在黏液腺癌中观察到。

GNAS或MAPK相关基因（KRAS、NRAS和BRAF）突变与发病年龄较小、组织学分级较低和侵袭水平降低显著相关。与之相对的是，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A、PIK3CA和PTEN体系突变与发病年龄较大、级别较高、淋巴结转移和较低的平均腹膜癌指数（PCI）相关。

生存分析显示，根据突变状态，两组患者的总生存率存在显著差异。如果患者携带TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A、PIK3CA和PTEN中的一个或多个突变（5 年生存率 55%），其生存期明显短于没有这些突变的患者（5 年生存率 88%）。重要的是，在平衡了组织学分级、腹膜癌指数（PCI）和细胞减灭术完整性（CC）评分后，多变量分析显示这些突变仍是预后不良的重要预测因素，表明这些基因突变可能会影响晚期患者的生存率，对患者的治疗具有一定的临床意义。

Wald等人的研究结果与Foote等人最近发表的文章类似。同样存在由TP53突变定义的与生存相关的黏液腺癌亚组。该亚组被作者称为“TP53突变主导”（TP53-mutation predominant），与缺乏TP53和GNAS突变的临床惰性“RAS突变主导”亚组相比，其总生存期明显较差。作者还确定了黏液腺癌中“GNAS突变主导”亚组和“三阴性”亚组与不良的生存结果相关，并进一步证明了这些亚型在组织学为结肠型和杯状细胞癌患者中的预后相关性。Wald等人研究发现，其队列中只有 4% 的GNAS突变肿瘤缺少RAS（或BRAF）基因的共突变，可能因此掩盖了GNAS和RAS突变主要亚型之间的生存差异。

作者表示还需要研究这些突变亚型与治疗的相关性。例如，当检出这些突变中的一种或多种时，是否会影响药物敏感性或耐药性？如果影响，该如何将这些信息纳入治疗选择过程？

鉴于检测成本的不断下降，约三分之一的阑尾癌患者可以在不到 50 岁时确诊，并且有 17% 的患者携带胚系致病基因。在这一现状下，可否为所有阑尾癌患者提供泛用的体系和胚系变异检测？或者是疑似致病变异的检测？

在发生突变进化的复发性LAMN患者中，观察多久是合适的？假设疾病残留越多，发生影响结果的关键突变的机会就越大，这一结论符合逻辑吗？这真的是文献中描述的PCI对生存的影响吗？此外，基因发生变异后多久会出现其表型效应？临床该如何在患者治疗中应用这些知识？

总之，目前缺少可识别的基因特征来确定阑尾癌患者有无进行CRS/HIPEC手术的资格或预测治疗疗效，这强调了进一步研究以及与临床工作相关的必要性。想在临床环境中可有效用于阑尾癌的基因检测，还需要取得更多进展。尽管如此，本文提及的研究工作意味朝着实现这一目标的方向迈出了有意义的一步。

参考文献：

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