首尔大学医院近期在《Br J Cancer》期刊发表了一项研究结果，该研究对 62 名转移性结直肠癌 (mCRC) 患者在一线姑息治疗期间连续采集的272份ctDNA 血液样本进行靶向基因（106个基因panel）测序分析，以探索液体活检在临床的应用效果。结果发现90.3% 的患者在治疗前检测到 ctDNA 突变。化疗后的 ctDNA 清除与更长的无进展生存期（PFS）相关，而与影像学反应无关（校正后HR 0.22，95% 置信区间为 0.10-0.46）。纵向ctDNA监测发现58.1%的患者提示ctDNA分子进展早于影像学进展（中位时间3.3个月）。疾病进展（PD）的患者可检测到多种耐药突变（34.9%）和基因扩增（7.0%）。检出新发突变的 PD 患者中有16.3%可能是靶向治疗或临床试验的潜在候选者。总之，与影像学评估相比，ctDNA监测可提供更准确的肿瘤动态变化信息及个性化治疗决策。
图1、研究流程（点击图片可放大查看）
图2、106个基因列表
为了更好的理解研究结果，我们先了解一下该研究是如何定义ctDNA 突变和 CNV：
从 cfDNA 样本中检测到原始变异后，通过PBMC(外周血单个核细胞)样本的检测变异信息滤除被认为是意义不明的克隆性造血(CHIP) 胚系及体系变异。ctDNA突变阈值定义为突变丰度（VAF ）≥ 0.3%且变异等位基因计数 ≥ 6，以滤除噪音、污染或测序错误。最后，通过肉眼观察比较纵向 ctDNA 突变谱，用人工校正假阳性。对于CNV，定义扩增（amplifications）为拷贝数 (CN) ≥ 6，拷贝数增加（CN gains）为CN ≥ 4且统计标准P值小于 0.01。
平均 VAF 定义为计算每个样本中检测的所有 ctDNA 突变的 VAF 平均值。ctDNA 清除定义为基线样本中检测的所有高于阈值的突变或 CNV 的消失。持续的 ctDNA 清除定义为在至少两个连续样本检测结果中均为 ctDNA 清除。
研究结果
患者特征：
该研究纳入 62 名 mCRC 患者。患者特征如图3。患者的中位年龄为 62 岁，男性占 61.3%。最常见的转移器官依次为肝（74.2%）、肺（32.3%）、腹膜（19.4%）和淋巴结（19.4%）。患者的姑息治疗方案由主治医师酌情选择。在 PFS 和缓解率方面，化疗（FOLFOX 与 FOLFIRI）或靶向疗法（西妥昔单抗与贝伐单抗）之间没有差异。
图3
所有患者在开始治疗前都进行了基线抽血，与治疗开始的中位间隔时间为 6 天。采样间隔是在治疗期间每四个化疗周期之后，如果患者在没有化疗的观察期，则大约每 2 个月采样一次。在 11.2 个月的中位随访期间，共收集了 272 份血液样本（平均每位患者 4.4 份样本）。在研究期间共有50 名（80.6%）患者发生疾病进展，其中43 名（69.4%）患者采集到疾病进展时的血液样本。
治疗前（基线）ctDNA样本检测的突变谱：
在基线时，62 名患者中有 56 名（90.3%）检测到ctDNA 变异（图4），共包括467 个 ctDNA 突变，每位患者的中位突变数为 4.5（范围 0-157），其中有两名患者（一名携带MSI-H）的肿瘤突变负荷 (TMB) 异常高（分别有 157 和 36 个突变）。常见的突变发生在基因APC (79.0%)，其次是TP53 (79.0%)、KRAS (41.9%)、SMAD4 (21.0%)、TCF7L2 (14.5%) 和PIK3CA (12.9%)。
图4、所有 62 名患者在治疗前检测的基因变异谱
此外，在10 名（16.1%）患者的 ctDNA 中检测到 5 次扩增和 6 次拷贝数增加（图5）。基于治疗前的 ctDNA变异情况，携带RAS、BRAF、PIK3CA突变和KRAS、BRAF 拷贝数增加的患者显示出统计学上更短的 PFS。
图5
31 名 (50.0%) 患者在医学中心进行了可与 ctDNA数据相比较的组织 NGS panel（FIRST Cancer Panel v.3，包括184基因）检测。将治疗前 ctDNA 测序结果与组织测序结果进行比较分析，ctDNA检出了84.4% (114/135) 的组织突变。有一名患者的肿瘤组织检出了扩增（ERBB2和TOP2A），在其ctDNA样本中同样检出。61 名患者可获得Sanger 测序或 NGS 检测的KRAS和NRAS基因状态结果。ctDNA与组织的RAS基因检测一致率为88.5%（54/61）。七个不一致病例中有四名为仅在其 ctDNA样本中检出KRAS突变，这四名患者中有3名患者的ctDNA和存档肿瘤组织样本的基因测序突变结果完全不同（图6）。
回顾这些患者的临床病史，发现这三名患者都同时或先后患有另一种原发性结直肠癌。SCR40 和 SCR54 患者有两种结肠原发性肿瘤病变。从每位患者的其他结肠病变获取的组织测序结果与ctDNA 突变谱相同。SCR59患者先后患有两种不同类型的结肠癌，复发时用更晚期的乙状结肠癌组织进行的基因检测，但肿瘤复发后获取的 ctDNA 代表的是升结肠病变的基因突变情况。
图6、ctDNA 与肿瘤组织突变不一致的 3 例患者
考虑到由于瘤内异质性导致的组织和ctDNA检出突变情况不一致，研究者通过评估校正使ctDNA 和组织NGS测序结果的总体一致性增加到 86.5%，KRAS基因分型的准确性也增加到 93.4%。
ctDNA清除与治疗结果：
比较了 51 名患者在每个时间点检测到的所有 ctDNA 突变的平均 VAF值。在 51 名患者中，50 名（98.0%）患者的平均 VAF 有任何程度的下降，其中32 名患者（62.7%）在首次随访评估时观察到 ctDNA 清除（图7a）。
图7
另外 6 名患者在治疗后期（范围 3.7-7.1 个月）获得了 ctDNA 清除。实现 ctDNA 清除的 38 名 (74.5%) 患者的 PFS 显著长于未达到 ctDNA 清除的患者（P< 0.001，ctDNA 清除 (+) 的中位 PFS 为 11.8 个月，ctDNA 清除(-)为 7.5 个月，图 7b）。表现出持续 ctDNA 清除的患者在统计学上也具有更长的 PFS（P =0.002，图 7c）。ctDNA 清除率在不同影像学反应的患者中没有显著差异（部分反应 (PR) 为 80.6%，疾病稳定 (SD)/疾病进展 (PD) 为 60.0%，P=0.16）。此外，化疗或靶向治疗的类型并不影响 ctDNA 清除。多变量分析显示 ctDNA 清除（校正后HR 0.22）和影像学反应（校正后 HR 0.16）与 PFS 独立相关。无论影像学反应如何，持续的 ctDNA 清除（校正后HR 0.16）与 PFS 相关。
重要的是，CT 影像学反应（PR 或 SD/PD）类型相同的患者可根据 ctDNA 清除情况表现出不同的 PFS。在 PR 患者中，达到 ctDNA 清除的患者 PFS 更长（P= 0.027，ctDNA 清除（+）的中位 PFS 为 15.9 个月， ctDNA 清除（-）为 10.7 个月，图 7d）。 SD 或 PD 患者根据 ctDNA 清除状况不同，PFS 也不同（P= 0.001，ctDNA 清除（+）的中位 PFS 为 10.8 个月，ctDNA 清除（-）为 3.4 个月，图 7d）。不同持续ctDNA清除状况的PR患者， PFS 存在较大差异（P= 0.003，持续 ctDNA 清除（+）的中位 PFS 为 19.7 个月，而持续 ctDNA 清除（-）为 10.9 个月，图7e）。持续 ctDNA 清除 (-) 组包括未获得 ctDNA 清除的患者和仅在单个时间点获得短暂 ctDNA 清除的患者。
通过连续ctDNA检测监测肿瘤疾病进展：
从51 名患者的基线到数据截止期间获得完整的连续血液样本。在 51 名患者中，43 名患者发生影像学进展（PD），另外8 名患者仍在观察中，没有任何疾病进展的证据，均处于 ctDNA 清除状态（图8）。
图8、持续清除 ctDNA 而没有疾病进展的示例
51 名患者中有 6 名在基线时没检测到任何的ctDNA 突变，在这些患者的随访样本中也未检出其他ctDNA 突变。 25 名（25/43，58.1%）患者的 ctDNA分子进展早于影像学进展，中位时间为 3.3 个月（范围 1.6-12.2 个月），分子进展定义为检测到新的 ctDNA 突变或预先存在的 ctDNA 突变丰度增加。
图9、51 名患者从随访至研究结束的治疗过程
在疾病进展过程中ctDNA 变化模式可分为三种：（1）治疗前 ctDNA 突变的进展，（2）其他新发突变的进展和（3）未检测到 ctDNA 突变的进展（图 9）。在 35 名患者 (35/43, 81.4%) 中发现治疗前基线ctDNA 突变增加或再次出现。20 名患者随着肿瘤进展再次出现基线 ctDNA 突变（图 10b），15 名患者显示除基线突变外的新发突变（图 10c ）。有8 名患者出现疾病进展但未检测到 ctDNA 突变，值得注意的是这8名患者的疾病进展部位均发生肝脏以外的转移灶。而在PD时ctDNA 升高的患者中有 74.3% (26/35)为疾病进展发生在肝脏转移灶（P<0.001）。通过对 ctDNA 进行纵向的 CNV 监测也可表现出肿瘤的变化状态。在治疗过程中， ctDNA ERBB2（HER2）拷贝数变化显示出与突变 VAF 相似的趋势（图10d）。与 HER2 阳性患者一样，其他基因的拷贝数变化也同样可以反映患者的病程变化。
图10、疾病进展期的 ctDNA 突变谱示例
从 43 名 PD 患者中共确定了98 个新发生的 ctDNA 突变，其中在 15 名（34.9%）患者中发现了治疗前基线未检测到的新突变。在 98 个突变中有26 个 (26.5%) 被 ClinVar 数据库注释为致病或可能致病性变异，与治疗耐药相关，特别是有7名 (16.3%) PD 患者检出的新发突变，可能是靶向治疗或临床试验的潜在候选者。有3名患者PD 时检测到了新的BRAF V600E 突变，该突变可能是 BRAF/MEK 抑制剂和抗 EGFR 抑制剂的靶点。然而，在这3名患者均出现与BRAF V600E共存的其他新发突变——KRAS突变（2名为 G12C，1名为 G12A） 。另一名患者检出了BRAF V600E共存的新发PIK3CA E524K 突变。还有其他 3 名患者新发生了 RAS/MEK 通路基因突变（KRAS G12D/Q61H、NRAS Q61L/ KRAS扩增和MAP2K1 K57T）。1 名患者检出了NF1 截短突变（ NF1 E595*），可能是靶向RAS/RAF/MEK 通路药物的临床试验候选者。
此外，一些接受西妥昔单抗治疗的患者在疾病进展时显示出多种已知的耐药突变。如图 10c所示，患者新获得了 4 个 RAS 通路基因突变（KRAS Q61L、NRAS Q61L、Q61K 和BRAF V600E）和 2 个EGFR胞外域突变（EGFR G465R、S492R），这些均为熟知的抗 EGFR 抑制剂西妥昔单抗的耐药突变。同样，其他 4 名接受西妥昔单抗治疗的患者也同时检测到影响 RAS 通路基因、EGFR和PIK3CA基因的多重耐药突变和扩增(图11)。所有这些接受西妥昔单抗治疗的患者在疾病进展前均保持RAS和EGFR野生型的状态。
图11、抗EGFR治疗后出现多重耐药突变的示例
讨论
该研究针对 mCRC 患者在一线姑息治疗期间连续采集的血液样本进行NGS 测序，以全面分析纵向 ctDNA 监测在mCRC 患者中的临床应用价值。90%的患者在治疗前基线的 ctDNA 样本中检测到基因变异，不仅包括 SNV，还包括 CNV。治疗后 ctDNA 的变化反映了肿瘤对治疗药物的反应（肿瘤缩小或再生长）。治疗后的 ctDNA 清除能够在相似影像学变化的患者中进一步区分出对治疗反应更好的人群，并且早于影像学变化之前检出新发耐药变异的患者可早期预警肿瘤的进展风险。因此ctDNA 纵向监测可为mCRC 患者整个病程中的个性化治疗决策提供可靠的信息。
与之前的报道一样，该研究也证实了 ctDNA 可以有效地揭示治疗后患者的肿瘤异质性和ctDNA动态变化。RAS 基因突变是目前 mCRC 治疗选择的最重要的生物标志物之一，在11.0% 的本研究入组人群ctDNA样本中检测到该突变，这与之前的报道相似。在三名同时或依次患有多原发性肿瘤的患者中，如果没有 ctDNA检测，就不可能在未行活检的转移灶中确认发生哪些优势克隆突变。已有很多研究提出肿瘤空间异质性是肿瘤患者产生不同治疗反应的原因，这表明使用 ctDNA评估对于药物选择的重要性。此外，34.9% (15/43) 的患者在疾病进展时检测的ctDNA突变谱与治疗前基线不同。
通过评估ctDNA 突变丰度的变化也可以预测治疗反应。尽管在开始治疗后的第一次评估中，除一名患者外的其他所有患者（98.0%）均检测到突变的 VAF 下降，但化疗后的 ctDNA 清除可预测更长的 PFS。ctDNA 清除可以进一步区分 RECIST 1.1 相同治疗反应分类下的患者，为传统的影像学评估提供了额外的信息。在该研究中显示，如果达到ctDNA 清除，还能持续ctDNA清除，则在PR 患者会有甚至更长的 PFS，这表明 ctDNA 可以敏感地反映治疗期间癌症的动态变化。关于预测治疗反应的精确 ctDNA 评估策略仍然存在争议，在未来的研究中还应考虑更实际的应用策略，例如结合 ddPCR 和 NGS 方法以降低纵向监测的成本。
ctDNA（尤其是基于 NGS 的方法）检测的准确度是非常重要的问题。不仅要关注敏感性，测序错误或非肿瘤相关的突变假阳性风险也值得关注。在该研究的所有患者中，90.3% 的患者检测到ctDNA突变，略高于其他研究。在患者血液中可检测到的 ctDNA突变，有高达 87%是可通过组织测序鉴定出的。虽然研究者做了很多努力，但仍有一部分转移性疾病患者无法检测到ctDNA 突变。血液样本中 ctDNA 突变的检测可能受到各种因素的影响，例如患者的肿瘤负荷或转移状态、样本采集和制备的质量以及测序技术的能力。然而，即使在最佳实验条件下，不可否认的是仍有一小部分肿瘤患者的ctDNA 释放量较少，这可能是由于肿瘤的固有性质决定的，如解剖位置、肿瘤血液供应或血管生成的差异，或其他尚待阐明的生物学因素。在 mCRC 中，似乎除肝以外的转移病灶释放到血液循环中的 ctDNA 明显少于肝病灶，与之前的研究结果一样，需要进一步深入研究了解 ctDNA 的生物学特性。因此，在临床中解释 ctDNA的检测结果时，应考虑其局限性，特别是在腹膜种植转移患者中。
为了降低假阳性，研究者用 PBMC 测序数据过滤掉 CHIP 以及胚系突变，并且对于反复出现的类噪音突变“黑名单”进行额外过滤后，能够保证鉴别出较低 VAF 的突变。然而，即使在这样的情况下，仍然可检测到低VAF值、未知临床意义的新发突变，特别是优势克隆已被清除或显著减少的治疗后。关于这些突变是亚克隆还是假阳性，目前还无法从该研究中得出结论。将来进一步改进分析流程，如选择片段大小选择和积累更多与临床信息相关的 ctDNA 测序数据，可能有助于提高数据准确性。
这项研究有几个局限性。首先，研究队列的患者均为医生个体自行选择的接受第一次姑息治疗的mCRC 患者，因此临床环境和治疗决策各不相同，导致不同临床方案中的患者入组数量较少。其次，研究者并不计划在患者化疗开始后立即收集样本。因此，在治疗四个周期后的第一个评估时间点，62.7% (32/51) 的患者 ctDNA 已经清除，无法确定最佳评估时间点或早期清除对治疗反应和患者生存期的影响。然而，在本研究第一次评估时的 ctDNA 清除仍然可以将不同治疗反应的人群区分开来，在该时间点之后又有15.8% (6/38) 的患者ctDNA 清除。此外，有报道称，如果在开始治疗后过早评估，则 ctDNA 变化的预测能力可能会受限。总之，通过肿瘤ctDNA分析和纵向 ctDNA 监测可以可靠地指导癌症患者的临床治疗决策。