本文报道了一例基于ddPCR平台检测到BRAF V600E变异的肛门黑色素瘤。BRAF V600E是黑色素瘤中常见的可靶向基因变异。出乎意料的是，BRAF V600E突变型与野生型拷贝数的比率很低（0.3%），而组织切片上的肿瘤细胞占比为＞90%。通过进一步检查，BRAF V600E免疫组化检测（IHC）证实了一个非常小的BRAF V600E阳性细胞亚群，二代测序（NGS）panel检测结果显示了致病性KIT变异p.L576P，变异丰度为63%。研究者最初假设黑色素瘤的主要驱动因素是KIT变异，而一个小亚克隆是由ddPCR检测到的BRAF V600E驱动（NGS未检测到，其检测限为5%）。为了确定这两个克隆之间是否有形态学差异，研究者对组织学进行了仔细复查，结果显示BRAF V600E阳性细胞的形态学不同，包括淡色细胞质、核凹槽和浸润嗜酸性粒细胞。IHC检测BRAF V600E阳性细胞显示CD1a、Langerin和S100共表达，诊断为朗格汉斯细胞组织细胞增生症（LCH）。这一诊断出乎意料，如果没有高灵敏度的分子检测，会被漏诊。而这一诊断对患者有临床意义。这个案例报道提出了关于黑色素瘤和LCH之间的生物学相关问题，此外，强调了在分子数据解读中整合定量信息的重要性。
病例
患者男，74岁，因直肠疼痛就诊。检查发现肛门肿块，组织学和免疫组化检查诊断为黑色素瘤（由于病变累及肛门两侧，故不确定是原发性皮肤病变还是粘膜病变）。PET/CT扫描未发现局部或卫星病灶，也未发现远处或淋巴结转移（临床分期：N0M0）。患者接受了切除术，随后进行了分子检测，以指导治疗和预后。然后在梅奥诊所进行了基于微滴式数字PCR（ddPCR）平台的BRAF V600E/K检测。检测前，检查组织切片并评估肿瘤细胞占比为＞90%。对载玻片上的整个肿瘤组织进行检测，检测结果显示为BRAF V600E变异，是黑色素瘤最常见的可靶向变异。值得注意的是，突变型与野生型拷贝数的比率低于肿瘤细胞占比（0.3% vs ＞90%；图1）。这一差异促使研究者进一步调查其原因。
图1
研究者首先进行了BRAF V600E免疫组化检测（IHC），以证实该变异的存在。结果显示，BRAF V600E IHC只染色了一小部分细胞（图2），这证实了ddPCR结果。这一发现最初被认为是在黑色素瘤中罕见地存在携带BRAF V600E的亚克隆，而大多数剩余的肿瘤细胞（BRAF V600E阴性）具有不同的驱动变异。为了验证这一假设，研究者随后进行了黑色素瘤二代测序（NGS）panel（BRAF、GNAQ、GNA11、KIT、NRAS）检测，以评估是否存在其他驱动基因变异。结果显示为KIT变异，c.1727T＞C（外显子11），p.L576P，变异丰度为63.2%，与肿瘤细胞占比非常匹配。该黑色素瘤NGS panel的检测下限为5%，因此未检测到低频BRAF V600E变异。此时，研究者怀疑黑色素瘤的主要部分是由KIT变异驱动的，而一个小亚克隆是由BRAF变异驱动。从临床角度来看，亚克隆BRAF V600E的检测在治疗管理方面具有不确定的意义，因为理想情况下，靶向变异应该是克隆而不是亚克隆。
图2
最后，研究者想了解携带BRAF V600E的亚克隆在形态学上是否与由KIT L576P驱动的主体黑色素瘤部分不同。研究者仔细回顾了肿瘤的组织学，发现BRAF V600E阳性细胞实际上更小，其特征是细胞核有凹槽/折叠，核仁不明显，细胞质丰富，呈淡色嗜酸性（图2）。此外，这些细胞内混合有增多的嗜酸性粒细胞。所有这些形态学特征均提示为朗格汉斯细胞组织细胞增生症（LCH）。随后进行了其他免疫组化检测，结果显示BRAF V600E阳性细胞也强表达CD1a、Langerin和S100，而Melan A、CD163、c-kit阴性（图3）。值得注意的是，黑色素瘤细胞的细胞核呈多形性，具有明显的核仁和丰富的嗜酸性细胞质（图2），且表达Melan A、c-kit和弱S100（图3）。这一IHC模式支持局灶性LCH合并黑色素瘤的诊断。
图3
研究者想对LCH病灶和黑色素瘤成分进行单独的显微切割，从而进行单独的分子检测，以更好地表征每个实体的基因组图谱，以及分析共享的变异和通路激活。然而，LCH病灶太小且界限不清，无法进行上述分析。需要进一步的研究来调查同时发生的LCH和黑色素瘤之间可能存在的关系，无论是否存在共同的BRAF致病性变异。
术后给予患者局部放疗。肿瘤治疗团队计划用抗PD-1辅助免疫疗法对患者进行为期1年的治疗。术后约8个月PET/CT复查提示左侧腹股沟淋巴结肿大，怀疑转移。在另一家医院进行了淋巴结切除术，并证实许多淋巴结仅为转移性黑色素瘤阳性，而可获得的临床记录中没有提到LCH的形态学证据。当然，其他机构未采用ddPCR等敏感方法进行BRAF V600E检测，以排除低水平LCH受累。临床团队目前正在考虑用于治疗黑色素瘤的其他免疫疗法，并且正在监测患者是否存在LCH及其程度。
讨论
高灵敏度通常是分子诊断工具的理想特征，可以实现准确的诊断和高阴性预测值。然而，将定量结果与其他临床和实验室检查结果相结合对于准确解读检测结果至关重要。本文报道了一例基于ddPCR平台检测到BRAF V600E变异的肛门黑色素瘤。令人惊讶的是，与评估的肿瘤细胞占比（＞90%）相比，BRAF V600E变异是低频信号（0.3%，突变/野生型拷贝数比）。这一差异促使研究者对组织学进行了仔细审查，这反过来又有助于识别意外的共存疾病过程。该案例反映了在分子检测中，整合定量信息对于数据解读是非常重要的。基因致病性变异的变异丰度可揭示肿瘤的克隆结构，并有助于确认组织学或临床上可能不明显的克隆异质性。
朗格汉斯细胞组织细胞增生症是一种具有不同临床表现和预后的异质性疾病。常见的基因变异涉及MAPK/ERK通路，其中BRAF V600E发生于约50%的病例。LCH与恶性肿瘤（包括皮肤黑色素瘤）共存的病例之前已经报道过（表1），其中一个病例的结果与本病例相似，皮肤黑色素瘤与一个非常小的邻近/混合性LCH病灶相关。值得注意的是，此前也曾报道过几例与儿童非恶性黑素细胞病变相关的LCH病例（表1）。这将是第一个描述LCH与粘膜黑色素瘤相关的病例，LCH的数量很少，并且客观上很难通过组织学评估来检测。能够检测LCH并解读明显不一致的分子发现对患者具有重要意义，特别是对于BRAF V600E变异的解读。
表1
成人LCH可能是局灶性的或多系统受累，其治疗及预后取决于所涉及的器官系统。例如，成人非肺性、单灶LCH往往预后良好，5年总生存率为94%。然而，复发也有可能发生在不同的器官系统。因此，临床随访极为重要。值得注意的是，研究提示，在一线和复发治疗中，BRAF V600E突变的LCH可使用BRAF抑制剂进行有效治疗。对于临床医生来说，了解LCH共存的恶性肿瘤非常重要，因为其可能影响临床治疗和疾病监测。总体而言，当LCH合并恶性肿瘤时，治疗LCH的决策可能取决于不同因素，包括LCH亚型（单灶、单系统肺部或多灶和多系统）、是否存在可靶向的BRAF变异、合并恶性肿瘤的类型和程度、以及患者的基线临床表现。从治疗黑色素瘤的角度来看，了解是LCH而不是转移性黑色素瘤携带BRAF V600E，也是至关重要的。最后，“真正”驱动基因变异KIT L576P的检测支持该肛门黑色素瘤起源于粘膜（而非皮肤），有助于更好地定义该病变并进一步优化治疗。
本病例强调了仔细分析并将组织学、分子和临床结果相关联的重要性。ddPCR等高灵敏平台是检测潜在可靶向致病性变异的重要工具，并且是患者个性化治疗的基础。从实验室的角度来看，除了评估是否存在致病性变异之外，量化该变异也很重要，以便更好地表征和理解所检测疾病过程的生物学特征。从临床角度来看，关注变异及其量化/频率将有助于专注正确的靶点，优化患者管理，因为服用不需要的药物可能与不服用有效药物一样有害。
参考文献：
Buglioni A, Guo R, Rumilla KM, Edgar MA, Markovic SN, Zheng G. An Unexpected Diagnosis Uncovered by Quantitative Molecular Findings: A Case Report. J Natl Compr Canc Netw. 2023;21(8):787-791. doi:10.6004/jnccn.2023.7014