慢性淋巴细胞白血病（CLL）是成人最常见的白血病。在通路抑制剂问世之前，化疗免疫疗法（CIT）是CLL最常见的治疗方案，在通路抑制剂可及性有限的地区仍广泛应用。CIT难治性的几种生物标志物已受到关注，包括免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因的未突变状态，以及TP53、BIRC3和NOTCH1变异。为了克服CIT耐药，靶向通路抑制剂已成为CLL的标准治疗，布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）和BCL2抑制剂的使用改变临床实践。然而，几种导致对共价和非共价BTK抑制剂耐药的获得性基因变异已被报道，包括BTK（例如C481S和L528W）和PLCG2（例如R665W）点突变。BCL2抑制剂维奈托克（维奈克拉，Venetoclax）耐药涉及多种机制，包括损害药物结合的点突变、BCL2相关抗凋亡家族成员的上调和微环境改变。最近，免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞用于CLL治疗的试验得到了相互矛盾的结果。研究者确定了免疫治疗的潜在难治性生物标志物，包括循环IL-10和IL-6水平异常，以及CD27+CD45RO−CD8+ T细胞减少。
研究背景
CLL是一种以成熟B细胞克隆性增殖为特征的血液肿瘤。近年来对CLL进行了广泛研究，发现其发病机制中涉及关键基因异常，如11q缺失、13q缺失和12三体。临床诊断需要外周血淋巴细胞计数≥5×109/L，以及特定的免疫表型谱，包括CD19、CD5、CD20、CD23和具有κ或λ轻链限制性的dim表面免疫球蛋白的克隆性表达。CLL是成人中最常见的白血病，在美国每年发病率为4.6/10万，其特点是死亡率相对较低，5年相对生存率接近90%。诊断时的中位年龄为~70岁，提示CLL是一种主要发生于老年人的疾病。
目前CLL的一线治疗是基于通路抑制剂联合或不联合抗CD20单抗。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）的CLL一线治疗指南包括BTK抑制剂（BTKi，即伊布替尼和阿卡替尼）、BCL2i维奈托克联用或不联用奥妥珠单抗（obinutuzumab），以及PI3Ki艾代拉里斯（idelalisib）联用利妥昔单抗，但后者由于感染性毒性而很少使用。NCCN最新指南一致建议将BTKi单药治疗（伊布替尼或泽布替尼），或者将阿卡替尼或维奈托克联合奥妥珠单抗用于CLL的一线治疗。对于复发/难治性（R/R）CLL，指南根据对一线治疗的应答情况推荐使用上述通路抑制剂之一，一些创新药物也在开发中。虽然异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是CLL的唯一治愈方案，5年无进展生存（PFS）率约为40%，但由于移植物抗宿主病（GVHD）及其并发症导致的死亡率较高（约为10%~20%），因此很少使用allo-HSCT。随着不同治疗方案逐渐被用于CLL的治疗，几种难治性生物标志物已被确定（表1）。本文旨在全面概述CLL对现有疗法（包括CIT以及通路抑制剂和免疫疗法）难治性的生物标志物。
表1
化疗免疫疗法难治的生物标志物
IGHV突变状态：
成熟B细胞表面表达B细胞受体（BCR），是抗原识别和B细胞活化的关键成分，由免疫球蛋白（Ig）和信号亚基组成。为了使Ig暴露于外细胞膜上，B细胞必须通过V(D)J重排对可变Ig基因进行基因重组，这一过程确保了BCR库的高度异质性。抗原识别后，初始B细胞移动到淋巴结生发中心（GCs），在那里发生IGHV基因的体细胞超突变（SHM），可能增加BCR对识别抗原的亲和力。
根据IGHV基因的突变状态，CLL可分为两个分子亚组：（i）IGHV未突变的CLL（U-CLL，约占所有CLL的40%），反映成熟B细胞未经历过GC反应，以T细胞非依赖的方式成熟；（ii）IGHV突变的CLL（M-CLL，约占所有CLL的60%），反映了成熟B细胞经历了GC反应和SHM过程。值得注意的是，临床实践中使用的阈值是患者IGHV序列与胚系核苷酸序列的偏差≥2%，才被认为是M-CLL。未突变的IGHV基因更常见于进展性或R/R CLL，而突变的IGHV基因更常在无症状或未接受治疗的疾病中检出。值得注意的是，未突变的IGHV基因见于高达60%的CLL，需要根据指南进行治疗。
除了预后价值之外，IGHV突变状态也是一个预测性生物标志物，U-CLL对所有现有CIT方案的应答均低于M-CLL。评估伊布替尼、阿卡替尼和泽布替尼持续治疗的临床试验在U-CLL中显示出良好的疗效，与M-CLL达到的疗效一致，克服了IGHV突变状态导致的治疗难治性。
TP53变异：
TP53位于17号染色体短臂（17p），是编码p53蛋白的抑癌基因。TP53体细胞突变是CLL中最常见的基因变异，其次是del(17p)。在新诊断的CLL患者中，有4%~8%的患者存在TP53变异，随着疾病的进展，TP53变异的发生率增加，在首次治疗时可达到10-12%，在氟达拉滨难治性患者中达到40%，在发生RS（Richter综合征，即CLL进展为侵袭性淋巴瘤）的患者中达到50-60%。因此，TP53变异是预后和预测的生物标志物。CLL8试验报告，在接受FCR（氟达拉滨、环磷酰胺和抗CD20单抗利妥昔单抗）治疗的患者中，TP53突变患者的中位PFS为15.4个月，中位OS为49个月，而TP53野生型患者的中位PFS为59个月，中位OS为未达到。在TP53变异的CLL中，BR（苯达莫司汀和利妥昔单抗）和Chl-O（苯丁酸氮芥和抗CD20单抗奥妥珠单抗）方案也出现了类似的不良结果，而基于BTKi的治疗取得了显著的疗效，与TP53野生型患者相当。
由于TP53变异对临床产生了显著影响，iwCLL指南建议在每一线治疗前通过荧光原位杂交（FISH）检测del(17p)和通过DNA测序检测TP53突变状态。除了这些建议之外，欧洲CLL研究计划（ ERIC）支持使用NGS进行TP53突变检测，因为与传统的Sanger测序相比，这种方法的特点是灵敏度更高。
BIRC3变异：
2-6%的CLL病例存在BIRC3基因突变或缺失。在CLL中，BIRC3的失活突变或缺失会导致构成性NF-κB通路激活，从而向白血病克隆提供促生存信号，如通过上调几个抗凋亡基因。
评估CLL患者接受FCR治疗疗效的一项回顾性研究表明，在BIRC3 变异CLL患者和TP53 变异CLL患者中，中位PFS率相似（分别为2.2年和2.6年），显著低于BIRC3野生型患者的PFS。此外，在CLL患者中比较维奈托克+奥妥珠单抗一线治疗与Chl-O一线治疗的CLL14 III期随机试验表明，接受Chl-O治疗的BIRC3突变患者预后较差，中位PFS为16.8个月。然而，基于伊布替尼和/或维奈托克的疗法似乎克服了BIRC3变异带来的耐药。
NOTCH1突变：
诊断时，约8%的CLL患者携带NOTCH1突变，但在氟达拉滨难治性CLL和RS患者中，这种基因病变的发生率升高，分别为20.8%和31.1%。此外，NOTCH1突变被认为参与了CLL免疫治疗的耐药。上述CLL8试验研究了NOTCH1突变对免疫治疗的预测价值。值得注意的是，在NOTCH1突变患者中，FC（氟达拉滨、环磷酰胺）队列和FCR队列的5年PFS率分别为25.8%和26.7%（p=0.974），疗效未因加用利妥昔单抗而改善。III期随机试验COMPLEMENT 1研究也获得了类似的结果，比较了苯丁酸氮芥单独治疗与苯丁酸氮芥联合抗CD20单抗奥法木单抗（ofatumumab），强调了NOTCH1突变在预测基于抗CD20单抗的免疫疗法难治性方面的作用。
如体外模型所示，NOTCH1介导的耐药机制似乎与HADC介导的对NOTCH1突变CLL细胞表面CD20暴露的抑制有关。值得注意的是，CLL11试验表明，Chl-O明显优于单独使用苯丁酸氮芥，Chl-O组的PFS和OS均较好，且与是否存在NOTCH1突变无关。因此，这些数据提示奥妥珠单抗较高的临床疗效可能克服了NOTCH1突变的影响。如RESONATE 3期随机试验所示，通路抑制剂是克服NOTCH1介导的对CIT和免疫治疗的难治性的可行方案，该试验中，在接受伊布替尼治疗的NOTCH1突变型CLL和野生型CLL之间，未发现PFS有差异。
BTK抑制剂难治的生物标志物
BCR信号通路在B细胞的发育和CLL的发病机制中发挥着重要作用。在CLL中，BCR通过配体依赖性和非依赖性机制发挥构成性活性，引起构成性BTK信号激活，从而赋予肿瘤细胞生存和增殖优势（图1）。
图1
第一代共价BTK抑制剂的难治性：
伊布替尼是同类首创的口服生物可利用的BTKi，于2014年被FDA批准用于治疗R/R CLL，改变了这种白血病的治疗格局。伊布替尼既可作为一线治疗，也可用于R/R CLL患者。伊布替尼作为一线治疗的安全性和有效性是由随机III期RESONATE-2试验确定的，该试验证明了伊布替尼与苯丁酸氮芥相比的优效性。在R/R CLL中，随机3期RESONATE试验证实伊布替尼优于抗CD20单克隆抗体奥法木单抗。
伊布替尼通过共价结合BTK蛋白ATP结合域的C481氨基酸残基不可逆地阻断BTK。伊布替尼占据ATP结合位点导致不同下游靶点（如Akt和PLCγ2）缺乏磷酸化，导致BTK信号抑制，进而在体外和体内减少BCR信号传导。除了靶内效应外，伊布替尼还使几种脱靶失活，如EGFR、ErbB2、ITK和TEC，这可能有助于抗肿瘤作用，但同时也会导致不良事件，如心房颤动（AF）和出血。
对第一代共价BTK抑制剂的原发耐药性：
10-16%的患者对伊布替尼原发耐药，但分子机制仍不清楚。CLL患者对伊布替尼耐药与高风险基因组特征和大量预处理相关。在部分初治CLL患者中发现了与BCR通路无关的基因变异，涉及ATM、BIRC3、NOTCH1、SF3B1和TP53基因。
重要的是，基线特征，如del(17p)/TP53和复杂核型（≥3个染色体异常），增加了接受伊布替尼治疗患者的疾病进展风险。在接受伊布替尼治疗的患者中，TP53变异是预测较差OS和PFS的唯一独立分子因素。因此，尽管与CIT相比有了很大的改善，但del(17p)/TP53患者的预后在一定程度上仍不理想，即使是基于靶向治疗。此外，del(18p)发生于一小部分未经治疗的病例，但在伊布替尼复发患者中发生率较高，并且与BTK突变相关，提示这种染色体异常在伊布替尼难治性中可能发挥作用。
对第一代共价BTK抑制剂的继发耐药性：
在接受BTK共价抑制剂治疗的CLL患者中，约60%最终发生继发性耐药。2014年伊布替尼获批后不久，就报告了第一例BTKi耐药突变。这些突变可分为两类：（i）点突变，通过改变激酶结构域内的目标半胱氨酸残基（C481）来阻止伊布替尼与BTK共价结合；（ii）通过PLCγ2构成性激活下游信号传导的突变（图1）。
在一项早期分析中，Woyach及其同事对6例获得性伊布替尼耐药患者进行了全外显子组测序，发现其中4例患者的BTK在481位有半胱氨酸到丝氨酸突变（C481S），该突变对应于伊布替尼结合位点。这项关键研究还揭示了伊布替尼的难治性至少利用了另一种分子机制。事实上，1例携带BTK低频C481S突变的患者携带3种不同的PLCG2突变：R665W、L845F和S707Y。第6例患者PLCG2基因第665位精氨酸突变为色氨酸（R665W）。在所有患者中，耐药时发现的突变在治疗开始前均不存在。
C481S突变后来被证实是CLL患者中最常见的介导伊布替尼耐药的突变。C481S突变的功能特征表明，BTK对伊布替尼的亲和力降低，只能产生可逆的抑制作用，而不能产生不可逆的阻断作用。除了481位点的半胱氨酸被丝氨酸取代外，其他氨基酸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甘氨酸的取代也有报道。除BTK基因突变外，BCR信号级联中BTK下游的PLCG2基因也参与伊布替尼耐药。特别是，PLCγ2 SH2结构域的R665W突变是一种功能获得性突变，导致PLCγ2的激活不依赖于BTK信号刺激。
对接受伊布替尼治疗的进展性CLL患者的连续样本进行深度敏感性基因分析，可以分别在进展前中位8个月和9个月检测到BTK和/或PLCG2突变克隆。最近，对法国登记队列进行的一项分析表明，在对伊布替尼仍有应答的患者中，BTK突变发生率为57%，这提示，在接受伊布替尼单药治疗的CLL患者中，有相当一部分已经携带耐药突变，但对治疗仍有临床应答。在这方面，现行指南不建议在发生临床耐药性之前检测BTK和PLCG2突变，但BTK和/或PLCG2突变可能是检测BTKi临床前耐药性的潜在生物标志物。值得注意的是，只有约70-80%的获得性伊布替尼耐药患者携带BTK和/或PLCG2突变。一些染色体变异也与伊布替尼继发性耐药相关，包括MYC扩增、del(18p)和del(8p)，这些染色体变异导致TRAIL-R的单倍体不足，导致肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡产生耐药。
对第二代共价BTK抑制剂的耐药性：
阿卡替尼和泽布替尼是不可逆、强效的共价BTK抑制剂，对结合位点的C481残基具有比伊布替尼更高的选择性。因此，这些药物对包括EGFR和ITK在内的TEC家族其他激酶的脱靶抑制较少，因此不良事件较少。III期随机ELEVATE-RR试验表明，在R/R CLL患者的PFS方面，阿卡替尼与伊布替尼相比具有非劣效性。最近，一项比较伊布替尼和泽布替尼治疗R/R CLL患者的III期随机对照试验显示，与伊布替尼相比，泽布替尼具有较高的ORR、较好的PFS和较低的心房颤动/扑动发生率。但对第二代BTKi继发性耐药也有报道。在接受阿卡替尼治疗的患者中，与伊布替尼相似，C481S突变被发现是疾病进展中最常见的获得性突变。此外，在同一队列中也检测到PLCG2突变的发生。相反，在接受泽布替尼治疗的进展性CLL患者中，BTK L528W突变以一定的比例被检出，并且似乎与疾病进展有关（图1）。
克服共价BTK抑制剂耐药性的方案：
BTK ATP结合袋中C481的点突变是CLL对伊布替尼耐药的很大一部分原因。为了克服这种耐药性，可逆的非共价BTK抑制剂已被开发出来，包括vecabrutinib、fenebrutinib、nemtabrutinib（ARQ 531）和pirtobrutinib（LOXO-305）。在临床前研究中，这些药物已被证明对BTK C481突变和未突变均有效。值得注意的是，BRUIN I/II期试验表明，在接受多线治疗的CLL R/R患者中，pirtobrutinib的ORR为62%，其中大多数之前已经接受过共价BTKi治疗。基于此，非共价BTKi为其他通路抑制剂（包括共价BTKi）耐药CLL患者提供了新的领域。尽管取得了这些重要的临床进展，但最近仍有几种导致非共价BTKi和一些共价BTKi获得性耐药的突变被报道，包括BTK酪氨酸激酶结构域的点突变，如V416L、A428D、M437R、T474I和L528W。这些突变的功能分析表明，这些氨基酸的变化破坏了BTK与非共价和共价BTKi的结合。Blombery等人最近一致地描述了与接受伊布替尼治疗的患者相比，接受共价BTKi 泽布替尼的患者中BTK-L528W突变的增加，这增加了泽布替尼和新型可逆的非共价BTKi之间交叉耐药的可能性（图1）。
目前正在研究克服上述BTKi耐药的不同策略。特别是，关于与PLCG2突变相关的伊布替尼耐药CLL，体外研究表明，抑制SYK和LYN（两者均是PLCγ2激活所必需的，且不依赖于BTK）可以克服持续生存信号传导。在最近的一项期 II研究中，SYK抑制剂entospletinib使既往接受过B细胞受体通路抑制剂治疗的患者达到缓解，即使在有BTK和PLCG2突变的患者中也是如此。然而，ORR低（33%），PFS为5.56个月。
此外，蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）可能成为克服BTKi耐药的新方法。研究表明，PROTACs可通过泛素介导的蛋白降解诱导BTK降解，从而有效对抗体外突变型BTK-C481细胞。NX-2127是BTK的首个靶向蛋白降解剂，在一项临床前研究中，NX-2127可诱导野生型和突变型BTK的降解。最近报道了NX-2127的首次人体I期临床试验结果。该研究共纳入23例R/R CLL患者，中位既往接受过6种治疗（2-11种）。所有患者既往均接受过共价BTKi和/或维奈托克治疗。在中位随访5.6个月时，NX-2127使12例可评估患者的ORR为33%。该患者组无其他治疗方案。这些数据支持在双重或三重难治性患者中使用BTK降解剂，无论BTK或BCL2突变状态如何。
BCL2抑制剂难治的生物标志物
线粒体凋亡由BCL2家族控制，该家族包括促凋亡蛋白（Bak和Bax）、抗凋亡蛋白（即BCL2、BCL-xL和MCL1）和仅BH3蛋白（即BIM、BID、BAD、PUMA、BIK和NOXA）（图2）。
图2
不同的异常机制导致了BCL2在CLL肿瘤发生的初级阶段过表达，包括13q14的miR-15和miR-16缺失（在40-60%的CLL患者中可检测到）以及BCL2基因的低甲基化。miR-15和miR-16通过与相应mRNA上的特定序列结合，生理上抑制BCL2蛋白的翻译。在CLL中，这两种miRNA的缺失导致BCL2水平升高，为肿瘤提供了生存优势。
维奈托克（以前称为ABT-199）是一种口服给药的首个BH-3模拟药物，旨在对BCL2具有高亲和力和选择性，对MCL1和BCL-xL具有低亲和力，而MCL1和BCL-xL对血小板存活至关重要。维奈托克最初于2016年被批准用于有del(17p)或TP53突变或不适合BCR抑制剂治疗的复发性CLL患者，以及无del(17p)或TP53突变且CIT和BCR通路抑制剂难治的患者。尽管维奈托克和抗CD20单抗联合治疗取得了重大临床成就，但仍有一部分患者治疗失败或进展。在这方面，在克隆进化的驱动下，长期维奈托克治疗最终会导致耐药克隆的扩增和进展。已提出了多种机制来解释维奈托克耐药，包括基因突变导致的药物结合减少、BCL2相关抗凋亡家族成员的上调以及微环境的改变。
对BCL2抑制剂的原发耐药性：
对维奈托克的原发耐药与肿瘤内异质性性和克隆演变相关。CLL亚克隆中预先存在的突变可能通过提供一定的生长优势或获得支持性微环境生态位而导致耐药性。原发性维奈托克耐药也可能是由于表观遗传机制，包括DNA甲基化、翻译后组蛋白修饰和染色质重塑。这些改变调节生长速度和对环境压力的反应，最终影响肿瘤异质性和克隆进化。在上述机制的基础上，各种微环境信号（IL-10、CD40L等）也通过刺激TLR9，进而激活NF-κB信号，从而导致内源性耐药。重要的是，转录因子NF-κB的激活导致抗凋亡蛋白BCL-xL和MCL1的表达增加。
对BCL2抑制剂的继发耐药性：
与伊布替尼耐药类似，也有导致维奈托克耐药的点突变报道。第一个发现且最常见的突变是BCL2的BH3结合沟中的G101V，该突变导致约15%接受维奈托克治疗的CLL患者出现耐药性。这一突变使BCL2对维奈托克的亲和力降低了180倍，从而阻止该药物从BCL2中取代促凋亡BH-3蛋白（例如BIM）。此外，还发现D103Y和F104I突变可引起耐药性（图2）。然而，G101V和D103Y在一些患者的临床复发前均可检测到，这提出了一个假设，即在未来，这些基因变异可能被视为治疗失败的预测性生物标志物，并导致早期干预，例如通过添加其他治疗药物，如BTKi。
BCL2突变仅在一部分患者中发现，这一事实提示导致维奈托克耐药的其他机制也参与其中。抗凋亡BCL-xL和MCL1的过度表达与耐药风险较高相关。Ghia及其同事一致发现，无论IGHV突变状态如何，维奈托克治疗前后1年内，ROR1的高表达均与加速的疾病进展和较短的OS相关。值得注意的是，ROR1表达的增加伴随着WNT5a-ROR1信号的上调，导致ERK1/2和NF-κB靶基因（包括BCL-xL蛋白）的高表达，这可能会增强维奈托克的耐药性，因为它抑制细胞凋亡，并且不是维奈托克的明显靶点。此外，包含MCL1和PRKAB2（AMPK通路的一个组分）的1q23扩增以及这两个基因的过表达已在维奈托克耐药患者中得到证实。
奇怪的是，在维奈托克治疗前和维奈托克耐药时，对CLL患者队列进行的全外显子组测序和甲基化分析表明，BCL2未发生基因变异。然而，大多数患者发生了其他癌症相关基因的突变，包括BRAF、NOTCH1、RB1和TP53，或者CDKN2A/B纯合缺失，这提示涉及这些基因失调是潜在耐药机制。最后，NOTCH2的过表达也可能是维奈托克耐药的一种新机制。事实上，Fiorcari等人最近报道，携带12号染色体三倍体的CLL患者的NOTCH2水平较高，导致MCl-1上调，而MCl-1又通过逃避维奈托克的促凋亡作用促进细胞存活。
克服BCL2抑制剂耐药性的方案：
由于BTKi和BCL2i抑制不同的生物学通路，因此一个明显的临床策略是使用BTKi治疗维奈托克耐药患者。在两项结果相似的回顾性系列研究中，对于接受维奈托克治疗的疾病进展（PD）患者（包括携带BCL2突变的患者），BTKi达到了84%~91%的ORR和32~34个月的中位PFS。发生维奈托克耐药的既往BTKi不耐受患者可通过BTKi再挑战获得持久缓解，与之前在临床过程中使用的BTKi相比，首选替代BTKi。相比之下，PI3Ki与维奈托克治疗后的不良预后相关（中位PFS，5个月）。
最近的研究表明，利用HDAC抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂或溴结构域读取器蛋白抑制剂靶向表观遗传机制，可以下调不同血液系统恶性肿瘤中与维奈托克耐药相关的基因表达特征。在这方面，一项体外分析表明，溴结构域和末端外蛋白（BET）抑制剂JQ1在CLL中具有抗肿瘤作用，更重要的是，JQ1和维奈托克的联合应用增强了BCL2i的凋亡作用。这些数据表明，在维奈托克耐药的情况下，BET抑制剂作为二线治疗的潜在疗效。此外，由于MCL1上调已被证明与维奈托克耐药相关，因此MCL1直接拮抗剂AMG-176已被证明可选择性杀伤CLL细胞，并在体外与维奈托克协同作用。然而，由于安全性问题，该药物的I期试验（NCT03797261）不得不停止，这为未来MCL1抑制剂的开发留下了余地。
免疫治疗难治的生物标志物
用于CLL免疫治疗的新型药物正在研究中，即免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体（CAR）-T细胞和双特异性/三特异性T/NK细胞结合剂。近年来，治疗难治性的潜在生物标志物受到重视，包括循环IL-10和IL-6水平异常以及特异性记忆T细胞群的减少。
IL-10水平异常：
据报道，与早期CLL患者和健康患者相比，晚期CLL患者的循环IL-10水平更高。IL-10是一种由CLL肿瘤细胞分泌的抗炎细胞因子，部分通过其受体IL-10R的胞内信号抑制CLL中观察到的抗肿瘤免疫反应，IL-10R由多种细胞类型（包括T细胞）表达。最近，IL-10被认为参与了PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂免疫治疗的难治性。
PD-1/PD-L1轴是最常见的免疫检查点之一，在预防异常T细胞反应中发挥重要作用。PD-1是在正常T细胞的细胞膜上表达的分子，其与生理上存在于抗原提呈细胞表面的配体PD-L1结合。这种相互作用通过PD-1的胞内结构域触发信号通路的转导，导致PI3K/Akt和MAPK激活受到抑制，最终导致T细胞耗竭和功能受损。由于PD-1和/或PD-L1在各种肿瘤中过度表达，抗PD-1 /PD-L1单抗阻断这一轴已被证明在多种癌症类型中有效，包括血液系统恶性肿瘤。CLL患者在T细胞表面过表达PD-1，在肿瘤B细胞外膜过表达PD-L1，从而提供了一种免疫耐受环境，使肿瘤逃避细胞凋亡。
尽管免疫检查点抑制剂治疗有充分的理论依据，但一项II期研究的结果显示，抗PD-1单抗帕博利珠单抗缺乏疗效，复发性CLL患者的总缓解率（ORR）为0%。由于血清IL-10水平与免疫检查点抑制剂的耐药性有关，因此尝试将免疫检查点抑制剂与IL-10抑制联合应用。最近，在CLL小鼠异种移植模型中，同时使用IL-10抑制剂和帕博利珠单抗治疗取得了初步的结果。由于IL-10的抑制，帕博利珠单抗降低肿瘤负荷的疗效被放大了4.5倍，这为进一步研究IL-10作为耐药性预测生物标志物和可用药靶点的潜在作用铺平了道路。
CAR-T细胞耐药性的潜在生物标志物：
CAR-T细胞是从患者体内提取并经过改造后表达合成受体的T淋巴细胞，能够通过细胞毒性机制特异性靶向并杀伤肿瘤细胞。在T细胞提取和体外基因工程之后，CAR-T细胞经过扩增过程并输入患者体内，患者之前接受过淋巴细胞清除预处理方案。然而，抗CD19 CAR-T细胞治疗CLL并没有达到预期的效果，平均完全缓解率约为30%，与急性淋巴细胞白血病和弥漫大B细胞淋巴瘤相比显著降低。抗CD19 CAR-T细胞治疗CLL的耐药机制已被提出，主要是由于肿瘤克隆促进T细胞耗竭。目前提出的耐药机制包括免疫突触形成受损、CLL细胞表面CD19表达减少、产生肿瘤来源的细胞外囊泡以及T细胞上跨膜抑制性受体（如CTLA-4、LAG3和PD-1）表达增加。
最近，对接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的CLL患者进行的基因组、表型和功能评估确定了对治疗产生应答的潜在预测生物标志物。较高的血清IL-6水平与治疗应答呈正相关，使血清IL-6低水平成为CAR-T细胞免疫疗法难治性的生物标志物。另一个候选预测生物标志物是在CAR-T细胞产生之前，应答者中存在显著的CD27+CD45RO−CD8+ T细胞群，但需要进一步研究来确定这些发现的临床价值。由于CAR-T细胞免疫疗法的难治性主要是由于T细胞耗竭，因此正在评估CAR-NK细胞免疫治疗方法用于治疗CLL 。CAR-NK细胞是从健康供者的脐带血或外周血中提取的经过工程改造的NK细胞，旨在在其表面表达CAR受体，以利用NK细胞对目标肿瘤细胞的细胞毒性反应。尽管正在进行的I/II期试验（NCT03056339、NCT04796675、NCT04245722）使用CAR-NK细胞治疗CLL已经获得了早期有希望的结果，但还需要进行更多检测来评估这一新型疗法的安全性和疗效。
结论与展望
在过去几年中，几种通路抑制剂被用于CLL的治疗，一方面带来了无需化疗的治疗策略和较高的临床缓解率，另一方面也导致了新的耐药性机制的出现。值得注意的是，在接受这些创新药物治疗的患者中，对通路抑制剂（即BTKi和BCL2i）的治疗耐药性已逐渐得到阐明。克服这些新挑战的需求为理解难治性的详细分子机制和开发新的通路抑制剂铺平了道路。尽管现行指南不建议对通路抑制剂有应答的患者进行耐药突变的序贯检测，但在接受通路抑制剂治疗的CLL中，寻找可能有助于识别临床前耐药的预测性生物标志物也是值得探索研究的。
通路抑制剂（尤其是BTKi）不间断单药治疗给患者施加的持续选择压力，可能促进了相当一部分患者出现耐药突变。因此，使用有时间限制的治疗方法来避免持续的药物暴露，以及BTKi和维奈托克耐药克隆的筛选是规避耐药性发展的潜在策略。耐药一旦出现，克服耐药的一个令人鼓舞的策略是开发下一代BTKi，这种BTKi不与靶点共价结合，因此在CLL细胞中仍然有活性，并且最常见的耐药突变发生在结合域。在这方面，pirtobrutinib已被证明对携带与共价BTKi难治性相关的BTKi突变的R/R CLL患者有效。同时，新的获得性突变也被描述为导致对非共价BTKi（如pirtobrutinib）的耐药机制。
最后，关于CLL免疫治疗难治性生物标志物的了解仍然很少。CAR-T细胞治疗后应答的预测生物标志物包括血清IL-6和CD27+CD45RO - CD8+ T细胞水平，而关于双特异性和三特异性T/NK细胞接合剂的难治性，目前尚无充分数据。因此，需要进一步的研究来证实临床前研究和早期临床试验的初步结果。
参考文献：
Maher, N.; Mouhssine, S.; Matti, B.F.; Alwan, A.F.; Gaidano, G. Treatment Refractoriness in Chronic Lymphocytic Leukemia: Old and New Molecular Biomarkers. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 10374. https://doi.org/10.3390/ijms241210374