MET扩增是第二代和第三代间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂耐药的常见机制。在MET扩增/ALK重排（ALK+）肺癌患者中，靶向ALK和MET的联合治疗的缓解持续时间存在差异，提示肿瘤间异质性。然而，关于ALK+ NSCLC亚群的分子组成知之甚少。本研究查询了组织和血浆数据库，纳入了50多个同时存在ALK重排和MET扩增的样本。利用荧光原位杂交（FISH）和二代测序（NGS）量化MET拷贝数的范围，并描述共突变情况。FISH显示，75%的MET扩增ALK+ NSCLC组织样本存在高水平扩增（MET拷贝数与7号染色体着丝粒数的比值[MET/CEP7] ≥ 5）。观察到MET拷贝数的肿瘤内异质性，即使在整体低水平MET扩增的肿瘤中也发现了高水平扩增细胞。对48个MET扩增ALK+ NSCLC血浆样本的分析发现，在血浆中很少（17%）检测到高水平扩增。在组织和血浆MET扩增样本中，EML4-ALK变异体1最常见（51%）。ALK激酶结构域突变仅存在于少数MET扩增ALK+ NSCLC。MET扩增的ALK+ NSCLC血浆样本中TP53突变（81 % vs 45 %，p = 0.002）、EGFR扩增（17 % vs 4 %，p<0.001）和MYC扩增（21 % vs 3 %，p <0.001）频率高于MET未扩增的ALK+ NSCLC样本。本研究表明，MET扩增ALK+ NSCLC通常表现为组织高水平和异质性MET扩增，很少合并ALK突变，经常合并与侵袭性肿瘤生物学相关的变异。
研究背景
MET信号通路的激活主要由MET扩增导致，发生于15-20%的间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排（ALK+）非小细胞肺癌（NSCLC），这些肿瘤对下一代ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKI）具有耐药性。回顾性病例系列研究表明，一部分由MET驱动的ALK TKI耐药患者获益于靶向ALK和MET的联合治疗。ALK + MET联合治疗的缓解持续时间存在差异，一些患者经历短暂的缓解，而另一些患者则对治疗原发耐药。尽管缺乏评估双重ALK + MET阻断治疗的前瞻性试验，几项临床试验探索了MET抑制剂用于EGFR突变NSCLC，该分子亚群的MET扩增频率相似。在这些试验中，将MET TKI加入奥希替尼，30-50%的MET扩增EGFR突变NSCLC部分缓解，MET高水平扩增的肿瘤疗效最大。MET扩增水平与MET靶向治疗敏感性的这种相关性，与既往ALK/ROS/MET TKI克唑替尼用于MET扩增不伴其他致癌驱动基因共突变肿瘤的研究一致。回顾性分析表明，与这些增加对EGFR和MET联合治疗敏感性的因素相反，MET扩增和其他基因耐药突变共存可能会损害主要侧重于抑制MET旁路信号通路的疗法的疗效。因此，基于MET的联合治疗成功与否可能同时受到MET拷贝数和整体分子组成的影响。
为了更好地了解MET拷贝数范围和共突变情况，我们分析了50多例获得性MET扩增的ALK+ NSCLC患者的组织和血浆样本，评估MET拷贝数的肿瘤内异质性，识别可能影响靶向疗法敏感性的共突变。
研究结果
研究人群
组织队列来自在马萨诸塞州总医院（MGH）接受治疗的ALK + NSCLC患者，这些患者重复组织活检样本荧光原位杂交（FISH）检测到MET扩增。MET扩增定义为MET/CEP7≥2.2。当MET/CEP7≥5时，认为存在高水平MET扩增。对于每个组织活检样本，分析平均MET/CEP7比值（即50个肿瘤细胞核的MET/CEP7比值）和单个细胞MET/CEP7比值，后者用于评估MET扩增的细胞间异质性。此外，组织样本还进行了NGS检测，识别相关共突变。查阅MGH患者病历，获取人口统计学和治疗史信息。血浆队列来自Guardant360临床数据库中，2014年3月至2022年4月期间，Guardant360血浆样本检测显示存在ALK重排的NSCLC患者。血浆样本局部MET扩增定义为MET绝对拷贝数≥2.1。
组织队列
组织队列包括15例ALK TKI获得性耐药患者进展病灶的17个活检样本（表1，图1）。大多数患者没有吸烟史（n = 11，73%），所有患者在病程中都接受了第二代ALK TKI治疗。9例（60%）患者在继发MET扩增之前未接受过克唑替尼治疗。7例（46%）患者洛拉替尼治疗期间复发，此时初始活检显示MET扩增时。大多数（n = 13，87%）患者为腺癌。
表1. 组织活检样本分子检测结果
图1. 研究人群
血浆队列
对两个血浆队列进行分析（图1）。队列1包括48例MET扩增ALK + NSCLC患者的62个样本，通过查询Guardant360临床数据库识别。由于Guardant360数据库去除身份信息，无法获得有关临床病理特征和治疗史的信息。队列2也是常规Guardant360测序产生的去除身份信息的数据集，包括MET未扩增ALK + NSCLC患者的1500多个样本。
MET扩增ALK+肺癌MET拷贝数范围
组织活检样本MET拷贝数
首先分析了15例MET扩增ALK + NSCLC患者的16个组织活检样本，评估MET拷贝数范围（表1）。从整体队列17个样本中排除了1个样本，因为该样本是MET靶向治疗进展后获得的纵向活检样本。其余的样本获取时患者均未接受过专门针对MET扩增的方案。初始分析集中在总体MET/CEP7比值（即50个肿瘤细胞平均比值）。共分析了16个样本，包括1例洛拉替尼治疗进展时同时获取胸腔积液和腋窝淋巴结样本患者的2个样本。在12/16（75%）个样本中发现了高水平MET扩增（定义为总体MET/CEP7比值≥5），其余4个样本的MET/CEP7比值在2.2和4.9之间。在高水平MET扩增的12个样本中，6个（50%）的平均MET/CEP7比值为≥25。
接下来，计算了17个组织活检样本单个肿瘤细胞的MET/CEP7比值（图2-3）。为了评估MET拷贝数在不同治疗背景下的肿瘤内异质性，将初始数据集扩展到包括患者接受MET靶向治疗后收集的2个活检样本。除了添加这2个样本外，先前分析中的1例患者被排除在单个肿瘤细胞分析之外，因为该患者的活检是在外面做的，无法获取样本用于进一步分析。该队列17个样本中，8个MET/CEP7比值≥25，5个MET/CEP7比值在5-24之间，4个MET/CEP7比值在2.2-4.9之间。
图2. 单个肿瘤细胞MET/CEP7比值
图3. MET基因拷贝数肿瘤内异质性
在MET/CEP7比值≥25的8个样本中，单个细胞间的比值是统一的，每个细胞的MET/CEP7比值都≥25。相比之下，大多数（n = 4/5，75%）总体MET/CEP7比值在5和24之间的样本单个细胞MET/CEP7比值不同。例如，1个肝活检样本（图2，图3中的#7）的总体MET/CEP7比值为7.3，单个细胞的范围为2.5至≥25。1例患者（图2中的#12）同时存在局部扩增和多倍体。具体来说，所有单个肿瘤细胞中MET拷贝数≥25，各细胞CEP7探针拷贝数在1-4之间，总体MET/CEP7比值为14。最后，所有4个总体低水平MET扩增（MET/CEP7比值<5）的样本都同时包含MET未扩增细胞和高水平扩增细胞（图2-3）。总的来说，该结果支持ALK+ NSCLC患者组织活检样本MET拷贝数的肿瘤内异质性，提示即使在整体低水平MET扩增肿瘤中，一部分细胞也具有高水平扩增。
血浆样本MET拷贝数
在之前的一项研究中，我们证实Guardant360检测ALK+ NSCLC患者血浆样本MET扩增具有高灵敏度。该研究包括4例具有配对组织和血浆样本的MET扩增ALK + NSCLC患者，血浆的MET拷贝数低于相应组织。为了评估更大血浆队列中MET拷贝数的范围， 我们查询了Guardant360数据库，识别了48例血浆样本同时携带ALK重排和局部MET扩增的患者（血浆队列#1，图1）。这些患者血浆样本MET拷贝数范围在2.1-16.4之间（图4A）。28/48例（58%）患者的MET拷贝数在2.1-3之间。只有8例（17%）患者MET拷贝数≥5个。虽然我们没有该血浆队列的匹配组织，但结果表明，MET拷贝数的总体范围，特别是MET扩增水平较高的样本的分布，在血浆中可能比在组织中窄。
图4. MET扩增ALK阳性肺癌血浆MET拷贝数和共突变情况
MET扩增ALK+ NSCLC分子图谱
在EGFR突变NSCLC中，研究发现了MET扩增与其他耐药机制的重叠。为了评估这一发现是否扩展到MET扩增ALK + NSCLC，我们回顾了血浆和组织样本的分子图谱。
ALK激酶结构域突变
由于ALK激酶结构域突变是ALK TKI耐药的最普遍驱动因素，首先回顾了血浆和组织数据集，确定MET扩增和ALK激酶结构域突变共存情况。所有组织活检样本均不含ALK激酶结构域突变。9个（19%）血浆样本同时具有MET扩增和ALK激酶结构域突变（图4A）。由于MET扩增ALK+血浆数据库去除身份信息，治疗史不完整，无法确定这些ALK突变是否可能导致对上一种ALK TKI耐药。在3个（33%）ALK突变与MET扩增共存的样本中，血浆检测到的ALK突变为L1196M守门人突变，该突变与对下一代ALK TKI的耐药性无关。
其他基因共突变
接下来，分析血浆样本分子谱，确定最常见的共突变基因（图4B）。MET扩增ALK+ NSCLC血浆样本中突变频率≥10%的基因包括TP53（81%）和ATM（10%），扩增频率≥10%的基因包括MYC（21%）和EGFR（17%，图4B）。除了上述这些较常见的共突变外，潜在相关的耐药共突变包括KRAS G12D（n = 1）和NRAS G12D（n = 1）。评估了这些共突变在1500多个MET未扩增ALK + NSCLC血浆样本扩展数据集中的频率。MYC扩增（21% vs 3%，p < 0.001）、EGFR扩增（17% vs 4%，p < 0.001）和TP53突变（81% vs 45%，p < 0.001）在MET扩增的ALK+样本中频率更高，提示这些变异可能在MET扩增的ALK+ NSCLC中富集。
EML4-ALK融合变异体
ALK激酶结构域突变是ALK靶向治疗耐药机制之一，不同的EML4-ALK融合变异体可能与ALK激酶结构域突变发生倾向不同有关。为了评估MET扩增是否好发于携带某种特定EML4-ALK变异体的肿瘤，确定了我们血浆和组织MET扩增ALK + NSCLC数据集的EML4-ALK融合变异体。11个组织活检样本检测到EML4-ALK融合（表1），包括变异体1（n = 6）、变异体3（n = 2）、变异体5（n = 2）和变异体8（n = 1）。MET扩增血浆队列中，36例患者融合伴侣和EML4-ALK变异体信息可及，其中34例检测到EML4-ALK融合。其余样本的融合伴侣为KLC1和KIF5B。在血浆样本中观察到以下EML4-ALK变异体：变异体1（n = 17），变异体2（n = 2），变异体3（n = 11）和其他（n = 4）。总体而言，在51%（n = 23/45）的可评估的组织和血浆MET扩增样本中检测到EML4-ALK变异体1。
讨 论
尽管研究表明，MET扩增导致ALK TKI耐药，但关于该耐药机制的大型临床研究较少。为此，本研究纳入了50多例MET扩增ALK + NSCLC患者样本。本研究结果表明，MET扩增的ALK+ NSCLC通常表现为组织高水平MET扩增，且MET扩增经常与传统上与侵袭性肿瘤生物学相关的分子变异（TP53突变和MYC扩增）共存。
在多种情况下（作为新发致癌驱动突变和获得性耐药事件），MET扩增赋予MET治疗靶向敏感性，特别是当MET高度扩增时。由于耐药机制通常是亚克隆事件，因此可以想象，对ALK + MET联合治疗的反应深度和持续时间可能取决于疾病部位的MET拷贝数和MET拷贝数的分布。为了评估MET扩增ALK + NSCLC的分子异质性，我们进行了从单个肿瘤细胞到整体血浆的分析。通过该分析，我们观察道单个肿瘤活检样本肿瘤细胞间的MET拷贝数异质性，特别是在MET扩增水平较低的肿瘤中。然而，在我们的分析中，组织样本MET图谱主要由高水平MET扩增定义。在切除的EGFR突变NSCLC中也描述了MET扩增的空间异质性，特别是在FISH低水平或临界MET扩增肿瘤中。考虑到MET靶向治疗在MET扩增水平较高的EGFR突变NSCLC中疗效较好，高水平MET扩增的统一性可能是获益的预测指标，而肿瘤中同时存在非MET扩增细胞和低水平或临界MET扩增细胞可能对该疗法产生不利影响。在ALK + NSCLC中缺乏类似的前瞻性研究，或许可以评估临界或低水平MET扩增的ALK + NSCLC患者的早期反应，来确定基于MET的联合治疗的疗效。
关于MET扩增ALK + NSCLC的整体分子图谱，大多数血浆样本MET拷贝数≤5。血浆拷贝数受组织拷贝数和整体ctDNA脱落的影响，预计不会等同于组织拷贝数。组织与血浆中高水平MET扩增发生率的存在差异的原因之一可能是空间异质性导致MET拷贝数稀释。因此，在分析血浆拷贝数及其对估计组织拷贝数的潜在效用时，考虑异质性和肿瘤脱落非常重要。
此外，本研究还关注可能影响疾病生物学和对MET选择性疗法敏感性的高频共突变。在我们的血浆和组织样本中，很少观察到可操作ALK突变和其他可靶向基因共突变。血浆分析显示，在MET扩增ALK+样本中，>80%存在TP53共突变，TP53共突变及MYC和EGFR共扩增频率超过在MET未扩增ALK+ NSCLC中观察到的频率。值得注意的是，对Guardant360数据库的查询也显示，与非MET扩增的EGFR突变NSCLC相比，MET扩增的EGFR突变NSCLC中MYC扩增富集（11% vs 2.6%）。在ALK+ NSCLC和EGFR突变NSCLC中，MYC扩增和TP53突变都与侵袭性肿瘤生物学有关，这可能解释了接受EGFR和ALK靶向治疗的患者中，MET扩增与早期复发的有趣关联。此外，VISION研究显示，在一组血浆高水平MET扩增、没有其他致癌驱动因素的患者中，血浆MYC共扩增与特泊替尼的无进展生存期较短有关。因此，这些共突变可能会抵消高水平MET扩增的有利发现，对MET靶向治疗的反应持久性产生不利影响。
本研究有几个局限性。首先，尽管这是目前为止关于MET扩增ALK+ NSCLC的最大研究，但所研究基因型的整体罕见性以及我们分析对去除身份信息基因组数据集的依赖性阻碍了深入的临床分析。其次，我们的血浆队列缺乏配对的组织样本，因此无法评估MET拷贝数的组织-血浆一致性。第三，我们关于组织样本中MET拷贝数肿瘤内异质性的结论是基于对有限数量的样本的回顾。由于这些组织样本是通过对来自未经选择的ALK+ NSCLC患者的>100个组织样本的MET拷贝数的系统分析识别的，无意中过度代表侵袭性肿瘤的可能性较低。尽管如此，在更大的队列中进行独立验证对于确认我们的观察结果至关重要。第四，我们的分析不包括治疗史，因此不能得出关于基因变异对治疗结果影响的明确结论。最后，本研究关注MET扩增，而ALK+ NSCLC中已经描述了MET激活的其他非基因机制。鉴于基于抗体的MET靶向疗法的出现以及EGFR突变NSCLC中这些疗法的疗效与MET表达之间的明确关系，ALK+ NSCLC中MET旁路依赖性指标应在未来的研究中得到全面探索。
总之，本研究表明，MET扩增ALK + NSCLC通常存在高水平MET扩增，且通常与导致侵袭性生物学、预示不良治疗结果的突变共存，这可能从分子层面解释了为什么已发表病例系列研究中ALK + MET联合治疗的疗效中等。
参考文献：
Dagogo-Jack I, Kiedrowski LA, Lennerz JK. Molecular heterogeneity and co-altered genes in MET-amplified ALK-positive lung cancer: Implications for MET targeted therapy. Lung Cancer. 2023 Sep 23;186:107383. doi: 10.1016/j.lungcan.2023.107383. Epub ahead of print. PMID: 37813016.