9 月 20 日，全球第二例猪-人心脏移植手术在美国马里兰大学成功实施。2022 年 3 月，世界上第一位进行基因编辑猪心脏移植的患者大卫·贝内特（David Bennett），在术后存活达 60 天。
其使用的异种移植器官方案，是通过基因编辑技术将猪的基因改造接近于人类，从而减轻排斥反应。这一重大进展是在中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员赖良学21 年前取得的突破基础上，进一步对猪进行 10 个基因改造后获得的。
图丨赖良学（来源：赖良学）
当时，克隆羊技术刚刚开始起步。2002 年，在美国密苏里大学动物中心从事博士后研究的赖良学，成为基因编辑修饰克隆猪“第一人”，并通过基因敲除技术结合克隆技术，成功构建了半乳糖苷转移酶基因敲除克隆猪模型，一举解决了猪器官移植入人体的超急性排斥反应问题[1]，轰动整个学术圈。这项发表在 Science 的研究被美国国家研究资源中心认为是异种器官移植领域的重大突破，称该研究为“里程碑式进展”。
21 年后，赖良学与合作者们在基于大动物解决供体器官短缺问题的道路上，树立了又一重要的“里程碑”——首次成功在肾脏缺陷猪模型体内培育出人源中期肾脏[2]。 经统计，中肾内的人源细胞占比高达 70%。
“最激动人心的时刻，是当我们把嵌合胎儿拿出来，通过荧光显微镜观察到大片红色荧光出现在其腰部位置。这意味着，经历了五年的反复探索实验，离成功八九不离十了。”赖良学感叹道。
通过一系列后续实验排除了假荧光等因素，研究团队确认了来自猪肾脏位置的荧光正是人源细胞所发出。这些人源多能干细胞在肾脏缺陷胚胎中发育了 28 天后，成功嵌入到了猪的中肾内，进而形成中肾小管，使原本表现出缺陷的肾脏具有完整的结构。
图丨Cell Stem Cell 当期封面（来源：Cell Stem Cell）
近日，该项研究成果以封面论文形式发表于 Cell Stem Cell。封面上，是一只携百宝飞来的小猪。赖良学研究员表示，猪能飞是一件很神奇的事情，也是一件看似“不可能”的事情，这也预示着我们的这项研究“将不可能变为可能”。
有趣的是，这只会飞的小猪手中捧着一个葫芦，葫芦中装的“灵丹妙药”正是用于构建人源中肾的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。该团队获得的新型人源 iPSCs 是该研究成功的关键因素之一，在基因修饰技术改造和新型培养体系的加持下，这些细胞的分化潜能和生存能力大大增强，并最终成功使猪身上“长出”含有大量人源细胞的功能性实质器官。
“我们希望在猪体内再造的肾脏可用于造福人类。”赖良学研究员指出，该技术不仅能够用于人体器官的发育以及发育性疾病的研究，其“终极目标”是获得可用于人体器官移植的功能性器官。
让干细胞同时具备高分化能力和强生存能力
“在经历了不断的探索和失败，我们取得了成功。这看似偶然的背后，和团队过去在基因编辑、基因改造、胚胎操作、干细胞等领域每一步坚实基础和技术的累积都密不可分。”赖良学感叹道。
为获得异种嵌合能力更强的细胞，研究团队解决了两个关键问题。在前期工作中，米格尔·A·埃斯特万（Miguel A. Esteban）研究员课题组发现向干细胞培养基中加入四个小分子化合物以及白血病抑制因子，能够获得分化能力与人类早期胚胎细胞相似的干细胞。
干细胞与早期胚胎细胞的相似程度对其能否最终形成各种组织器官至关重要，而这一培养体系为干细胞赋能，使其具有了更高的分化潜能，为其在猪胎儿体内能够顺利形成目标器官提供了重要保障。
为了使人源细胞在异种体内更好地存活，潘光锦研究员课题组对种间差异障碍的机制进行探究。他们发现在人源干细胞中过表达 MYCN 和 BCL2 这两个基因，能够有效避免由于物种间差异导致的人源细胞在异种动物体内大量凋亡。课题组前期的研究成果也证明，过表达 MYCN 和 BCL2 的人源细胞可在血管缺陷小鼠体内生成人的血液干细胞。这样，在高分化能力和强生存能力的“强强联合”下，研究人员获得了异种嵌合能力强的细胞（4CL/N/B 细胞）。
（来源：Cell Stem Cell）
另一方面，该团队利用基因编辑技术，创制出了新型肾脏缺陷猪模型。具体来说，研究人员通过新型基因编辑工具，结合体细胞核移植技术及胚胎显微注射，克隆得到了肾脏发育关键基因 SIX1 和 SALL1 敲除的肾脏缺陷猪模型。
与此同时，研究人员利用新型基因编辑工具，将体细胞核移植技术和胚胎显微注射结合后，通过克隆得到了肾脏发育关键基因 SIX1 和 SALL1 敲除的肾脏缺陷猪模型。该多基因修饰的肾脏缺陷猪模型表现出严重的中肾发育缺陷，后肾完全缺失，为人源细胞提供充足的发育空间。
图丨胚胎内的人源化肾细胞（红色荧光）与野生型猪胚胎对比（来源：Cell Stem Cell）
此外，胚胎补偿技术体系的各个环节都会影响嵌合胚胎的发育，这也是实现人源器官异种体内再造所要解决的关键难题之一。在这方面，合作团队进行了多次尝试、走过了很多“弯路”，最终确定了构建嵌合胚胎的理想技术方案：向发育至桑葚胚以及早期囊胚阶段的重构猪胚胎，进行 3-5 个人类干细胞的注射。
同时，鉴于人细胞及猪胚胎在体外培养时需要不同的培养条件，研究人员还探索了适用于体外培养嵌合胚胎的培养条件。最终，确定了适用于培养嵌合胚胎的在体外培养体系。
结合上述构建的高分化潜能、强增殖及抗凋亡能力的多能干细胞，优化的胚胎补偿技术体系，以及多基因修饰肾脏缺陷猪模型。研究团队最终成功在猪体内再生了人源中肾。
图丨相关论文（来源：Cell Stem Cell）
最终，相关论文题目为《利用人多能干细胞基于胚胎补偿技术在猪再生人源中期肾脏》（Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation），并作为当期论文封面发表在 Cell 子刊 Cell Stem Cell[2]。
该论文第一作者为中科院广州生物医学与健康研究院博士后王教伟，共同通讯作者为赖良学研究员、戴祯研究员、米格尔·A·埃斯特万（Miguel A. Esteban）研究员、潘光锦研究员。
为获得供体器官提供新方案
在中国，因器官衰竭需要做器官移植手术的人数每年大概有 30 万，仅靠人体器官捐献远不能填补这一缺口。为此，科学家们也一直在探索更多可获取供体器官的新方法。找到适合的器官供体，意味着可以延长患者的生命并改善其生活质量。
通过生物工程技术在动物体内再造可用于移植的人源器官，是解决供体器官短缺的理想方案之一，该方案也被称之为“异种嵌合技术”。早在十几年前，这一策略的理论可行性已经在基于啮齿类动物的研究中得到验证。
由于小鼠和大鼠的妊娠期相近，胚胎发育时间也基本一致。因此在早期，科研人员首先基于二者进行了异种器官体内再造的相关研究。多项研究成果证明应用异种嵌合的策略，可在大鼠或小鼠体内实现胰脏、肝脏等多种器官的种间再造。
2019 年 11 月，中国科学院动物研究所周琪院士团队把猴子的胚胎干细胞注入猪胚胎中，并最终培育出 2 只体内含有猴子细胞的“嵌合体”猪，世界上首例“猪猴嵌合体”由此产生。该研究证明灵长类动物的细胞能够在猪的体内形成嵌合，但在嵌合体中，猴细胞的嵌合比率十分有限。这其中的重要原因之一，或许是研究中应用的载体猪没有提供器官生态位空缺。
2021 年 4 月，昆明理工大学灵长类转化医学研究院季维智院士与合作者在Cell上报道成功构建了首个“人猴嵌合胚胎”[3]。研究人员把人类干细胞注射至灵长类动物食蟹猴胚胎，二十天的体外培养后，人类细胞所占在嵌合胚胎中的占比达 4%。该项研究为研究人类胚胎的早期发育提供了重要参考。
人和猴都属于灵长类动物，起源关系更近，且猴子妊娠期为 5 个半月，和人类差异更小。但也正是由于这些原因，若将人猴嵌合胚胎植入代孕母猴并最终产出嵌合胎儿，可能会导致更为严重的伦理问题。
因而目前国际上仍不允许对人猴嵌合胚胎进行子宫移植。另外，构建基因修饰器官缺陷猴模型的技术体系尚不完全成熟、效率仍然较低。因此，目前尚无法基于人猴嵌合体获得可用于移植的人类器官。
图丨克隆猪（来源：赖良学）
那么，通过猪再造人类器官有哪些优势和差异呢？从猪的器官的结构、大小和基因来看，其与人相似，但二者在某些生理特征存在一定的差异，比如人的体温是 37℃，而猪的体温为 38.5℃，再如人猪胎儿还存在发育不同步的问题，从妊娠时间上来看，人和猪的胚胎发育时间上存在很大的差异，人的妊娠期为 10 个月，而猪的妊娠期在 114 天左右。
不可忽视的是，人们对异种移植会有一个隐性的担忧——将人源细胞嵌入在猪体内，猪会不会变成人类呢？
赖良学表示：“这在技术上实际上是做不到的，我们只是针对某个器官在猪体内进行培养。其中涉及的伦理要求是，不能在猪体内出现人类的神经细胞，以及人类的生殖细胞（精子和卵子）。”
在这次研究中，研究人员只在胎龄 28 天胎儿的脊髓内检测到了少量的人源神经细胞，但并未检测到人类生殖细胞的形成。未来，也将通过将人源细胞的神经及生殖发育关键基因敲除的方式，最大限度防止相关争议的产生。
从基因敲除克隆猪“第一人”，到首次在猪体内培育人源中肾
2007 年回国后，赖良学受聘为吉林大学畜牧兽医学院教授及中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员。研究方向主要包括基因修饰大动物模型构建及应用、新型基因修饰技术及克隆技术的开发及优化、人类及动物多能干细胞的分离培养等。
2018 年，他与暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授团队合作，在Cell 报道首次成功建立了亨廷顿舞蹈症转基因猪模型[4]。此外，他还构建出多种具有重要应用价值的功能性蛋白人源化猪模型，这些猪模型将可用于生产如胰岛素、凝血因子、血静脉蛋白等重要的医用蛋白制剂，具有广阔的市场前景。
在本项已发表的研究中，赖良学及合作团队在猪体内培养出人源肾脏。而基于这项工作，他们已经开始着手实现在猪体内再造如心脏、胰脏、肝脏、肺脏等其他重要器官。对于培养难度最大的心脏，赖良学说：“胰脏即便是发育不健全只有 70-80%，也可以存活。但心脏必须做得非常完善，才能保证维持生命。”
从理论上来说，随着干细胞技术的进步和个性化医疗的发展，未来可能实现这样的情景：患者想获得某种器官用来移植，可从皮肤中取出一块让其成为干细胞，然后在猪身体中长出相关器官。赖良学指出，这个器官取自患者自己，又用于同一个人，因此会大幅度降低排异反应，这种路径也会更具优越性。
他认为，未来需要最先攻克的问题是如何延长含有人源器官的嵌合胎儿在猪体内的发育时间。基于已解决的干细胞分化能力的问题，因此未来其可能提高的幅度不会太大。但同时他也指出，种间差异方面还要努力克服更多的障碍。例如，基因表达的差异（影响生成能力）等。
另一方面，如何解决人类和猪发育同步化的问题需要进一步解决。“我相信随着国家在该领域投入经费的增多，以及更多合作者的共同参与，这方面会取得更大的突破。”赖良学最后说道。
参考资料：
1.Lai, L.,……,Randall S Prather. Production of α -1,3-Galactosyltransferase Knockout Pigs by Nuclear Transfer Cloning. Science 295(5557):1089-1092 ( 2002).
2.Wang,J.,……,Lai, L. Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation. Cell Stem Cell 30,9,1235-1245 (2023). https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.08.003
3.Tan,T.,et al. Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivo. Cell 184, 8, 2020-2032 (2021). https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.020
4. Yan, S., ……, Lai, L., Li, X. A huntingtin knockin pig model recapitulates features of selective neurodegeneration in huntington's disease. Cell. 2018, 173(4): 989-1002.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9671127/
http://www.gibh.cas.cn/sourcedb_gibh_cas/yw/zjrcyw/200907/t20090711_2065032.html