本研究表明變異丰度（VAF）對於符合帕尼單抗聯合FOLFOX初始治療條件的RAS野生型轉移性結直腸癌（mCRC）患者是一個預後因素。VAF的鑑別能力高於基線CEA或RECIST，而這樣的比較評估對該研究領域來說是有必要的。VAF對腫瘤反應參數沒有任何影響，其影響程度在無進展生存期（PFS）方面一般，而在總生存期（OS）方面具有統計學和臨床意義。
研究背景
循環腫瘤DNA（ctDNA）除了在早期結直腸癌（CRC）中具有臨床應用價值，在轉移灶中也具有很好的作用，可用於預後分層、腫瘤反應動態和治療失敗監測、基線和縱向基因組分析。一方面，ctDNA中檢測到的腫瘤特異性變異可以根據其與抗EGFR單克隆抗體等特異性靶向藥物耐藥性或敏感性的相關性來指導治療選擇。另一方面，ctDNA的數量是癌症患者的一個候選預後因素。
在轉移性結直腸癌（mCRC）中，癌胚抗原（CEA）被廣泛應用於臨床實踐，以衡量疾病負荷和對現有治療方案的反應深度。影像學參數如實體腫瘤反應評價標準（RECIST）定義的靶病灶的總數在臨床試驗中有被記錄，腫瘤直徑在臨床實踐中被經驗評估，而這些參數有一定的限制，如評估的主觀性和觀察者之間不一致性。因此，需要在晚期癌症患者的臨床管理中應用新的腫瘤擴散替代生物標誌物。
初步研究數據顯示，與CEA和RECIST相比，ctDNA應答可能具有更強的鑑別能力，但基線ctDNA的預後作用需要在更大的數據集中進行研究，並需要對隨機臨床試驗進行探索性分析。基於這些考慮，在ctDNA中檢測到的克隆性基因變異的變異丰度（VAF）是疾病負荷的一個候選生物標誌物，可能對mCRC患者有預後價值。
本研究基於Valentino試驗，研究基線VAF作為RAS野生型mCRC患者的預後生物標誌物，且這些患者接受了抗EGFR的前期治療策略。此外，本研究將基線VAF與臨床常用的其他參數，即CEA和RECIST定義的靶病灶總數進行比較。
研究方法
Valentino的研究（NCT02476045）是一項多中心、隨機、非盲法、開放標籤Ⅱ期試驗，研究了RAS野生型mCRC患者在接受帕尼單抗/FOLFOX-4誘導治療後，使用帕尼單抗（B組）的維持無進展生存期(PFS)不劣於帕尼單抗聯合5-FU/LV（A組）。在簽署同意書的患者中，於基線和治療期間每8周進行一次液體活檢（LBs）(獨立於治療周期延遲)，直到疾病進展、撤回同意書或死亡。
在這個預先指定的探索性分析中，研究者納入了所有具有可評估基線LBs的臨床可評估隨機患者。採用盲法獨立中央回顧評估RECIST 1.1反應、早期腫瘤縮小(ETS)和反應深度(DoR)。由組織下一代測序(NGS)提供可用的腫瘤分析數據。
研究結果
患者特徵：
最終的研究隊列包括135名病灶可測量和基線LB可獲得的患者。總的來說，135名患者中有125名（92.6%）具有可檢測的ctDNA（檢測panel包括14個基因的熱點突變）。中位VAF為12.6%（四分位距範圍(IQR)：2.0-45.2%），中位CEA值為29.30ng/ml（IQR：8.51-139.10ng/ml）和中位RECIST定義的靶病灶之和為80.0mm（IQR：50.0–117.5 mm），cfDNA中位濃度為103.0 ng/ul（IQR：68.4–176.5ng/ul）。詳情見表1。
表1
值得注意的是，伴有肝轉移的患者VAF明顯增高。儘管採用了隨機分組，但在兩個研究組中仍觀察到VAF分布的顯著不平衡，FU/LV聯合帕尼單抗維持組VAF較高。VAF值、CEA值及靶病灶總數呈線性相關(圖1)。在大約一半的隊列中，TP53是VAF最高的基因（135例患者中73例，54.1%），其次是APC和PIK3CA（分別有31例和6例；圖2）。TP53也是中位VAF最高的基因，而RAS突變為亞克隆突變。
圖1
圖2
VAF對預後的影響：
研究者首先以中位值作為臨界值來評估VAF對預後的影響。VAF越高的患者PFS越短（mPFS：9.9 vs 12.7個月；HR：1.27，95%CI：0.89–1.82；p=0.181；Fig. 3a），OS明顯較差（mOS：21.8 vs 36.5個月；HR：1.82，95%CI：1.20–2.76；p=0.005；Fig. 3b）。維持期添加5-FU/LV至帕尼單抗的PFS獲益獨立於VAF(圖3c)。與試驗結果一致，維持治療組對兩個VAF亞組的OS均無顯著影響(圖3d)。值得注意的是，在多變量分析中，只有VAF與多變量分析中的OS和PFS相關，而CEA和靶病灶總數則沒有（表2）。此外，研究顯示VAF、CEA及靶病灶總數與腫瘤反應無顯著相關性。
圖3
表2
最後，研究者探討了cfDNA濃度對預後的影響。高cfDNA和低cfDNA患者（以中位數盲切）在OS或PFS方面沒有顯示出顯著不同的結果（分別為p=0.153和p=0.839）。
討論
本研究表明VAF對於符合帕尼單抗聯合FOLFOX初始治療條件的RAS野生型mCRC患者是一個預後因素。VAF的鑑別能力高於基線CEA或RECIST，而這樣的比較評估對該研究領域來說是有必要的。VAF對腫瘤反應參數沒有任何影響，其影響程度在PFS方面一般，而在OS方面則具有統計學和臨床意義。這些結果可能很容易解釋為，前期使用高活性治療方案引起的疾病控制可能在很大程度上獨立於腫瘤負荷，然而腫瘤負荷本身只是預後。
在本研究的患者分子亞組中，TP53、APC、PIK3CA、SMAD4和FBXW7是導致VAF值的關鍵基因，這些基因在CRC發展早期階段的高克隆性突變在生物學上支持了VAF值。在該數據集中，BRAF突變的頻率非常低。之前的研究表明，基線ctDNA中RAS或PIK3CA突變與Valentino研究中納入的組織RAS野生型mCRC患者較差的預後相關，表明這些變異可能導致抗EGFR治療的耐藥性。鑒於RAS突變為亞克隆突變，PIK3CA突變通常比其他突變表現出更高程度的空間異質性，研究者認為RAS或PIK3CA突變的亞群與高VAF患者不重疊。事實上，在一小部分患者中（n=12）RAS或PIK3CA檢測的VAF最高。因此，研究者推測高VAF的預後影響最有可能與疾病負荷有關，而不是抗EGFR耐藥機制的存在。然而，一個值得探討的假設是，患者具有高疾病負荷可能會增加對EGFR抑制劑產生耐藥性的風險，因為該亞組中存在最大的基因組異質性和克隆進化的多樣性。
考慮到基線VAF評估簡單快速，該生物標誌物具有幾個潛在的臨床應用：首先，它可能被用作未來隨機試驗的分層因子，或作為一種選擇標準來指導患者參加臨床試驗；其次，基於FOLFOXIRI方案的隨機研究的事後分析可能揭示ctDNA負荷的預測作用，並預測強化化療對高VAF亞組的益處相對較高。本研究未得出任何關於VAF在臨床實踐中的成本-效益的結論，特別是考慮到CEA的低成本和可重複性。然而，對於基線CEA值在正常範圍內的患者，VAF評估可能具有相關性。事實上，無創分子分析ctDNA檢測可以同時評估VAF。在本隊列中，只有一小部分患者檢測不到ctDNA，這不僅可能與特定組織類型和轉移部位的非脫落特性或分析前變量有關，還可能與較低的疾病負荷或此類因素的多樣性有關。
本研究存在很大的局限性。第一，缺乏對VAF動態的縱向評估。在化療期間，ctDNA水平下降早於CEA，可作為監測腫瘤反應速度和深度的早期標誌物，從而預測影像學再評估。然而，幾乎所有的RECIST反應患者4周內檢測不到ctDNA。由於VALENTINO試驗只在第8周時間點採集了第一個治療期血漿樣本，同時進行了影像學再評估，因此研究者無法評估VAF早期改變的預後影響。其次，LB檢測在血液監測和基因分型中的廣泛應用可能使醫生能夠評估疾病進展及其分子驅動因素。此外，根據前瞻性驗證，應確定重複LB檢測的臨床有效性，特別是與標準影像學相比這種監測的額外價值。值得注意的是，ctDNA水平或VAF的上升和下降可能會影響臨床試驗的設計。第三，該數據不能轉化為微衛星不穩定性高或RAS突變mCRC患者的人群，這些患者目前正在接受其他一線標準治療方案：分別是免疫治療和化療+/-貝伐珠單抗。
總之，該研究表明VAF是一種很有前景的預後生物標誌物，可能與符合抗EGFR前期治療方案的RAS野生型mCRC患者的初始疾病負荷相關。
參考文獻：
Manca P, Corallo S, Lonardi S, Fucà G, Busico A, Leone AG, Corti F, Antoniotti C, Procaccio L, Smiroldo V, Ratti M, Murialdo R, Racca P, Pagani F, Randon G, Martinetti A, Sottotetti E, Prisciandaro M, Ambrosini M, Raimondi A, Morano F, Pietrantonio F. Variant allele frequency in baseline circulating tumour DNA to measure tumour burden and to stratify outcomes in patients with RAS wild-type metastatic colorectal cancer: a translational objective of the Valentino study. Br J Cancer. 2022 Feb;126(3):449-455. doi: 10.1038/s41416-021-01591-8. Epub 2021 Nov 22. PMID: 34811502; PMCID: PMC8810873.