微衛星不穩定性（MSI）是預測免疫檢查點抑制劑療效的關鍵指標，然而只有1-2%的膽道癌患者具有這一特徵。研究人員對1例肝門膽道癌患者的兩份腫瘤組織標本（膽管狹窄處的鉗夾活檢術樣本，和鄰近淋巴結的超聲內鏡引導下細針穿刺活檢術[EUS-FNAB]樣本）進行了MSI檢查，在兩份樣本中觀察到不一致的結果——因為高度微衛星不穩定性（MSI-H）只在鉗夾活檢的樣本中被發現。雖然FNAB樣本比鉗夾活檢的樣本大10倍，但腫瘤細胞含量要低得多，這可能是一個導致MSI結果不一致的原因。此外，四種錯配修復（MMR）蛋白的免疫組化顯示為pMMR。該腫瘤對吉西他濱、順鉑和S-1耐藥，但對帕博利珠單抗應答良好。這表明需要謹慎選擇樣本和解讀檢測結果，以免錯過獲得有效分子靶向藥物的機會。
背 景
微衛星不穩定性（MSI）是篩查Lynch綜合徵和預測免疫檢查點抑制劑療效的關鍵指標。如今，MSI可作為晚期實體瘤患者對帕博利珠單抗的伴隨診斷（CDx），並被納入腫瘤精準醫療的多基因組檢測（MGPT）中。在日本，膽道癌（BTC）患者的數量不斷增加，2019年時達到2.2萬人以上。這些患者的總體5年總生存率為24.5%，不可切除患者的中位總生存期為14個月。雖然MSI-H在BTC中較為少見，僅出現在0.9-1.6%的患者中，但對應的分子靶向藥物帕博利珠單抗對晚期BTC有顯著療效（總緩解率為40.9%，總生存期為24.3個月）。本文報道了1例肝門BTC患者，其原發部位的鉗夾活檢樣本顯示MSI-H，而鄰近淋巴結的超聲內鏡引導下細針穿刺活檢（EUS-FNAB）樣本顯示微衛星穩定（MSS）。患者接受了帕博利珠單抗單藥治療，反應良好。
病 例
患者男，43歲，既往有腮腺良性腫瘤手術成功治療史，但無惡性腫瘤史。患者外祖父在50多歲時罹患癌症（無原發部位的信息），表姐在40多歲時罹患結直腸癌。患者因右側季肋部疼痛，到當地醫院就診，診斷為肝門膽管狹窄和肝內膽管擴張。未見發熱或黃疸。因疑似肝部BTC而被轉至日本靜岡癌症中心。患者血液檢查顯示，血清肝膽酶水平升高（GOT：147 U/L[正常範圍：10-40 U/L]，GPT：311 U/L [5-40 U/L]，ALP：601 U/L [38-113 U/L]，GTP：995 U/L[≤70 U/L]），血清腫瘤標誌物輕度上調（CEA：1.3 ng/mL[≤5.0 U/L]，CA19-9：41 U/mL[≤37 U/L]）（表1）。
表1 實驗室數據
增強CT顯示肝門膽管及臍部有直徑25mm的腫塊，肝門周圍淋巴結不規則腫大（圖1a，b）。鑒於淋巴結轉移已擴散至肝總動脈和腹腔動脈周圍，臨床醫生判斷不可手術。超聲內鏡引導下的細針穿刺活檢術樣本（EUS-FNAB，圖2a）顯示小的腺癌碎片散布在大量白細胞、紅細胞和纖維組織內（圖2b，c）。內鏡下逆行膽管造影證實肝門膽管狹窄（圖3a）。在膽管狹窄部位進行了四次鉗夾活檢（圖3b），結果顯示存在多簇腺癌組織（圖3c，d）。鉗夾活檢樣本的免疫組化（IHC）顯示，錯配修復（MMR）蛋白表達正常（MLH1，MSH2，MSH6和PMS2）。
圖1 患者CT檢查結果
圖2 超聲內鏡引導下細針穿刺活檢（EUS-FNAB）
圖3 膽管鉗夾活檢
患者接受吉西他濱、順鉑和S-1的全身化療，緩解持續4個月，但在第7個月時淋巴結腫大復發（圖1c，f）。經患者同意，進行了MSI的CDx和MGPT檢測。由於FNAB或鉗夾活檢樣本的組織量不足以進行兩項檢測，因此將FNAB樣本分配進行MSI檢測，將鉗夾活檢樣本分配進行MGPT檢測。MSI檢測顯示MSS（5個位點均未改變）（圖2e）。然而MGPT結果顯示了多個基因變異，包括MSI-H和高腫瘤突變負荷（TMB-H） （10.09Muts/Mb；TMB-H≥10Muts/Mb），提示免疫檢查點抑制劑有效。患者隨後開始接受帕博利珠單抗單藥治療（200mg / 3周），在開始治療2個月後緩解（圖1d，g），並在繼續接受2個月治療後出現進一步緩解（圖1e，h）。患者及其家人接受了Lynch綜合徵可能性的遺傳諮詢。向患者介紹了Lynch綜合徵的概念和MMR基因的胚系檢測的必要性，但患者拒絕接受檢測。
為了確定MSI結果不一致的原因，在顯微鏡下計算腫瘤細胞含量並測定樣本量。首先，獲取蘇木精-伊紅（HE）染色切片的鏡下圖，可視為用於DNA提取的切片。再應用圖像分析軟體測量組織總面積。在FNAB和鉗夾活檢樣本中，測量6個最明顯的放大區域（× 100）以確定腫瘤細胞含量，每個區域由>1000個核陽性細胞組成。通過軟體計算核陽性細胞數量，研究人員目測計算腫瘤細胞數量。FNAB總樣本面積為83.8 mm²，鉗夾活檢樣本面積為6.9 mm²。FNAB樣本的腫瘤細胞含量為0.8%，而鉗夾活檢樣本的腫瘤細胞含量為13.9%。
討 論
標準化療對晚期BTC的療效有限，基於CDx和MGPT的精準醫療開啟了新的治療格局。在BTC的精準醫療中，MSI-H是最有前景的分子標誌物，因為帕博利珠單抗顯示出顯著的緩解率（40.9%）和總生存期的延長（24.3個月）。儘管本文BTC患者對標準化療耐藥，但對帕博利珠單抗表現出良好的應答（圖1c-h）。個體化精準醫療需要高度的準確性和一致性，但本文病例的MSI檢測和MMR IHC存在不一致的問題。
一般來說，MSI檢測分為兩種方法：聚合酶鏈反應（PCR）擴增+毛細管電泳法和下一代測序（NGS）檢測法。這兩種方法都分析了高度敏感的微衛星位點，儘管分析的位點在NGS檢測中是保密的。即使在分析相同的腫瘤樣本時，MSI的敏感性也會根據MSI標誌物的選擇而略有不同；NGS可以檢測Promega標誌物、Idylla標誌物等原始標誌物。但由於PCR法（約10%）和NGS法（8.3-15.8%）的靈敏度相似，因此本病例中不一致的MSI結果應該樣本來源不同導致的。
使用不同腫瘤細胞含量占比的樣本（鉗夾活檢13.9%，FNAB 0.8%）可能會影響MSI結果，因為鉗夾活檢樣本（圖3c，d）為MSI-H， FNAB樣本（圖2b，c）為MSS。此外，FNAB組織樣本比鉗夾活檢樣本大10倍以上，但FNAB樣本主要由纖維組織、白細胞和紅細胞組成。EUS-FNAB已被用於診斷淋巴結轉移，甚至可以評估臨床分期和手術指征。由於淋巴結FNAB組織中腫瘤細胞含量低，雖然可用於進行病理診斷，但可能不是進行分子檢測的最佳樣本（腫瘤細胞含量占比遠低於10%）。對腫瘤組織進行顯微解剖可作為提高腫瘤DNA濃度的方法。同時，對位於肝門膽管遠端的BTC，鉗夾活檢被認為是一種有效的方法。臨床醫師需要小心罕見的不良事件，如出血和穿孔。
研究人員還測定了鉗夾活檢樣本中MMR蛋白的IHC，但評估結果與MSI結果相矛盾，因為MMR蛋白表達正常。BTC中MMR蛋白表達缺失（dMMR）的發生率很低（0.9-4.3%），與MSI-H相似。研究人員在一些BTC病例中分析了MSI和MMR IHC的一致性，結果顯示：胰膽癌的一致性水平（87.5%，28/32）顯著低於胃腸道腫瘤（99.3%，345 /438）（P = 0.001）。Ando等人分析了四例dMMR BTC患者的MSI，其中兩例患者為MSS（均為dPMS2腫瘤）。由於BTC活檢樣本中腫瘤數量較少，且存在非腫瘤細胞的「污染」的問題，因此如果用MMR IHC代表整個腫瘤，有時很難準確評估。此外，不同病理醫師對MMR IHC的評估可能不一致，特別是在異質表達的情況下。由於在晚期BTC病例中可採用的方案有限，並且大多數用於CDx或MGPT的樣本都是活檢組織，因此在評估MMR缺陷或MSI-H時需要謹慎。
總之，在BTC患者中，ICI的適用範圍是有限的，但在MSI-H患者中，ICI的顯著效果是可以預測的。對於未手術的BTC患者，MSI可能是腫瘤精準醫學或CDx的指征，臨床醫生應努力在採樣時獲得足夠數量和含量的腫瘤細胞，並且需要牢記MMR表達與MSI狀態之間可能存在不一致，特別是在使用小活檢樣本檢測時。
參考文獻：
Matsubayashi H, Todaka A, Ishiwatari H, Sato J, Niiya F, Kondo T, Ono H, Yamazaki K, Sasaki K, Kiyozumi Y. Discordant microsatellite instability findings in two samples from a patient with biliary cancer that responded to pembrolizumab. Clin J Gastroenterol. 2023 Jul 25. doi: 10.1007/s12328-023-01833-7. Epub ahead of print. PMID: 37490248.