王琪教授：肺癌液體活檢的理想與現實

黃鶴樓迎鴻儔客，古琴台逢翹楚才。2019年中國腫瘤標誌物學術大會暨第十三屆腫瘤標誌物青年科學家論壇，於12月6-8日在武漢歐亞會展國際酒店順利召開。會議期間，大連醫科大學附屬第二醫院王琪教授探討了肺癌液體活檢的現狀。

眾所周知，肺癌的發病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均位列第一，多數患者一經發現便是中晚期，轉移是肺癌死亡的最主要原因，因而肺癌的早期診斷、動態監測具有重要意義。

液體活檢，顧名思義，就是利用人體體液作為標本來源檢測獲取腫瘤相關信息的技術，具有無創、快速等優點，在肺癌臨床診療中有巨大發展空間。

液體活檢在肺癌中的應用

CTC是從原發性或繼發性腫瘤上脫落並進入血液循環的完整腫瘤細胞。CTC的存在，意味著患者患有轉移性疾病。對於大多數癌症患者而言，CTC的丰度極低，因此活檢通常從富集步驟開始，以便提高CTC的濃度。目前，CTC檢測的主要臨床應用是提供預後生存預測。

CTC單細胞基因組測序有助於闡明腫瘤類型、轉移及耐藥等分子作用機制；

CTC術後檢測有助於預後及復發風險預測；

CTC集群(CTC cluster)促進腫瘤細胞乾性形成與轉移發生。

ctDNA是片段化的DNA，由癌細胞在凋亡或壞死過程中釋放到血漿。ctDNA片段極其稀少，這使其分離和鑑定都變得十分困難。由於總的游離DNA（cfDNA）樣本中存在少量ctDNA，因此建議使用高度靈敏的技術來檢測，比如PCR和新一代測序（NGS）。目前，ctDNA已經用於肺癌患者的臨床管理和晚期黑色素瘤的疾病狀態監控。

外泌體是細胞內多囊泡體與質膜融合後主動分泌到胞外的直徑30~100nm膜性小囊泡，與腫瘤發生、轉移、血管生成等相關。

腫瘤自身抗體是指腫瘤在發生髮展過程中，腫瘤細胞內表達異常的蛋白可刺激機體免疫系統產生的抗體。肺癌血清自身抗體聯合LDCT可應用於肺癌早期篩查，肺癌血清抗體聯合胸部CT輔助肺癌早期診斷。

液體活檢在臨床應用中存在的問題

1. 液體活檢樣本存在的問題

基因突變檢出率和可靠性受樣本量及背景信號影響，需明確背景，建立靈敏的檢測手段。

2. 液體活檢技術存在的問題

目前大多數ctDNA檢測缺乏臨床試驗數據證明其有效性，不同的檢測平台結果一致性不佳。

液體活檢技術需要有規範的操作流程和質量控制標準，應開展更多大型多平台交叉驗證加以規範。

常用檢測手段存在一定局限性：表面標誌物依賴性、通量低等。

3. 液體活檢結果分析存在的問題

真實性和可重複性直接決定液體活檢的臨床有效性和實用性

克隆性造血引起的突變也存在於實體腫瘤組織中，可能被誤認為腫瘤相關突變，可行組織-血液配對檢測加以排除。

4. 液體活檢實際應用中存在的問題

液體活檢可監測肺癌病情演變，但是不同的檢測頻率對應不同的結果，可能誤導臨床決策。

影像學檢查會累積放射性損傷，臨床需要更敏感、特異、無創的檢測手段輔助肺癌早篩，但是對於ctDNA，ctDNA甲基化，WGS檢測的綜合評估仍缺乏足夠的靈敏度。

王琪教授課題組在液體活檢方面開展了一系列工作。隨著微流控技術對細胞生物學影響的不斷加深,以及其在集成樣品預處理和血液成分分析中的優勢，近年來，微流控晶片技術正逐步成為細胞分選的主要工具，王琪教授課題組基於微流控晶片技術，構建了三款各具功能的CTC捕獲裝置和一款單細胞檢測裝置。分別為「確定性側向位移（Deterministiclateral displacement，DLD）單一晶片捕獲裝置」、「DLD晶片和磁場負性分選晶片一體化的聯合捕獲裝置」和「CTC捕獲及原位鑑定聯合裝置」。

其中DLD單一晶片捕獲裝置利用確定性側向位移陣列原理將CTC和血細胞分離，分選效率達95.26%以上，白細胞去除率也可達到96.5%以上。為了提高CTC分選純度，最大程度排除白細胞的干擾，將DLD晶片和磁場負性分選晶片相結合構建了一體化的聯合捕獲裝置，其分選性能在DLD晶片分選的基礎上再次去除80%的白細胞。CTC捕獲及原位鑑定聯合裝置將CTC的捕獲識別和螢光免疫染色鑑定在單一的柵欄結構晶片內序貫完成，實現了富集、捕獲和鑑定分析一體化。

與國際公認的CTC捕獲裝置Cellsearch分選系統相比，它們不僅擁有出色的檢測效率，更具有所需血液量少、成本低、時間短等優勢。已經通過大連醫科大學附屬第二醫院、北京大學人民醫院等多家臨床單位應用，證實該裝置捕獲效率達95%以上。

研發的「單細胞檢測裝置」，通過對單個細胞阻抗脈衝信號的識別，實現了CTC在微流控晶片封閉系統內的高效、無污染的單細胞分選，為進一步進行單細胞分析提供了保證。經肺癌細胞的測試，該裝置可以完成單個細胞的精確分選和分析。目前，該套樣機相關核心技術已經申請專利22項，其中發明專利14項，獲批准授權7項。