口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的侵襲性強，死亡率較高。雖然OSCC的診治已取得很突出的成績，但是中晚期患者生存質量仍然很差。為了擴展OSCC的治療手段和提高OSCC患者的生存期，探索OSCC發病的分子機制、尋找診斷及預後的生物標誌物以及治療靶點的研究是目前亟待解決的課題。近些年，研究者發現非編碼RNA在機體生長、發育及病理方面發揮了重要作用，尤其是長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)調控著惡性腫瘤的發病、轉移以及復發，甚至參與了腫瘤的耐藥。因此，有必要深入探討lncRNA在OSCC發病過程中的作用機制。
作者：仇永樂1劉遠航2（1河北醫科大學第四醫院口腔科；2石家莊市二院口腔科）
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本研究通過篩選OSCC差異表達的lncRNAs和mRNAs，建立差異表達基因共表達網絡，挖掘節點基因。藉助GO和KEGG通路分析，研究差異表達lncRNAs的生物學功能。通過cis和trans方法預測並分析差異表達lncRNAs可能調控的靶基因。以期探索新的OSCC高效診斷標記物，發現新的治療靶點，為新型治療藥物和策略的研發提供依據。
方法
採用lncRNA表達譜晶片檢測3例OSCC及對應正常組織的轉錄本，確定OSCC的lncRNAs和mRNAs差異表達譜，構建差異表達基因共表達網絡，發掘網絡節點基因。利用GO及KEGG富集分析，預測差異表達lncRNA的生物學功能。採用cis和trans調控，預測差異表達lncRNAs的靶基因。選取部分差異表達的lncRNAs，應用qRT-PCR驗證晶片結果。
結果
1.差異表達lncRNA和mRNA數據分析實驗共篩選出2294條差異表達lncRNAs（上調lncRNAs為933條，下調lncRNAs為1361條），占所有可檢測lncRNAs的2.9%；1938條差異表達mRNAs（上調mRNAs為891條，下調mRNAs為1047條），占所有可檢測mRNAs的10.3%。
2.共表達網絡圖通過構建差異表達lncRNAs和mRNAs的共表達網絡，發現306個lncRNAs與其他mRNAs和lncRNAs發生著相互作用，其中TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1這兩個lncRNA為發生相互作用最多的基因，是整個網絡的節點基因，關係度數值分別為22、21。而其他沒有發生直接作用的基因，也憑藉著與相關基因的間接作用，跟這兩個節點基因發生相互作用。因此，我們推測這兩個基因可能是OSCC發病過程中的關鍵節點基因（見圖1）。
圖1 lncRNAs與mRNAs共表達網絡圖。網絡每個點表示一個基因，點大小代表基因關係度數值，直線表示基因間相互作用，粉色表示mRNAs，青色表示lncRNAs，紅圈表示上調，綠圈表示下調。
3.GO和KEGG通路研究GO研究結果顯示，差異表達基因分別在分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞成分(CC)中富集。其中，富集度排名前三位的是interleukin-1 binding (GO:0019966; ontology: molecular function; P=0.0003)、response to interferon-alpha(GO:0035455; ontology: biological process; P=1.37E-10)、establishment of epithelial cell apical/basal polarity(GO:0045198; ontology: biological process; P=0.0003)。KEGG通路研究顯示，差異表達的mRNAs主要富集在38個生物學途徑中。其中，包括許多與癌症相關的途徑，如「pathways in cancer」(富含36個差異表達基因)，「bladder cancer」(富含8個差異表達基因)，「pancreatic cancer」(富含11個差異表達基因)等。
4.靶基因預測靶基因預測結果表明，1470條差異表達的lncRNAs具有cis或trans靶基因。其中，1356條lncRNAs作用於1250條cis靶基因，370條lncRNAs作用於2454條trans靶基因，256條lncRNAs同時具有cis和trans靶基因。GO研究顯示，MF靶基因主要在分子結合上富集，如「anion binding」、「ion binding」等。CC靶基因主要在細胞膜和細胞器官上富集，如「aggresome」、「organelle membrane」等。BP靶基因主要富集在合成過程，如「cellular biosynthetic process」、「organic substance biosynthetic processs」等。KEGG通路研究顯示，靶基因主要富集在43條通路。其中，腫瘤通路是主要通路，但是靶基因也參與了其他通路，如「biosynthesis」、「metabolism」、「signal pathway」等等。這些富集度較高的通路，可能在lncRNAs調控OSCC發生髮展過程中發揮著重要作用（見圖2-5）。
圖2 Cis調控下GO富集度前30位的條目
圖3 Trans調控下GO富集度前30位的條目
圖4 Cis調控下KEGG富集度前30位的條目
圖5 Trans調控下KEGG富集度前30位的條目
5. qRT-PCR驗證選取10個表達差異lncRNAs，在72例OSCC及正常組織中進行qRT-PCR驗證，檢驗晶片結果準確性。結果顯示，OSCC中lnc- MANSC4-8:1、CXCR2P1、NRIR、lnc-CMPK2-1:3和lnc-GLI3-4:1顯著上調，而TMPRSS11BNL、MEG3、lnc-WRN-10:1、DANCR 和lnc-TPP2-7:2 顯著下調，提示驗證和晶片兩者結果一致。
討論
本實驗，我們利用lncRNA晶片篩選OSCC差異表達基因，由結果獲得很多差異表達lncRNAs和mRNAs，說明本實驗晶片篩選效率極高。隨後，為了驗證lncRNA晶片結果的可信度，我們隨機選擇了一些差異表達的lncRNAs進行qRT-PCR驗證，分析得出兩者表達情況一致，說明實驗篩選結果準確而可靠。研究中我們發現，下調錶達的基因數量更多。說明在OSCC發展過程中，下調的lncRNAs作用更為顯著。此外，通過建立差異表達lncRNAs和mRNAs的共表達網絡，我們確定了兩個關鍵節點lncRNA，分別為lncRNA TMPRSS11BNL、lnc- WRN-10:1，屬於下調錶達lncRNA，以前從未在OSCC或其他實體腫瘤中報道過。這兩個lncRNA特異性機制及相關信號通路有待進一步研究，最終成為OSCC早期診斷、治療及預後評估的分子標誌物。
參考文獻：
Qiu YL, Liu YH, Ban JD, et al. Pathway analysis of a genome-wide association study on a long non-coding RNA expression profile in oral squamous cell carcinoma[J]. Oncol Rep. 2019, 41(2):895-907.