本研究探索了參加KCSG BR18-14/KM10B試驗的經過多線治療的HER2+轉移性乳腺癌患者的累積基因變異。對92例患者治療前循環腫瘤DNA（ctDNA）進行靶向測序。還分析了7例獲得>12個月持久緩解的患者疾病進展時的ctDNA。在99個樣本中發現65個基因存在致病性變異。變異發生率最高的基因是TP53（n = 48），PIK3CA（n = 21）和ERBB3（n = 19）。TP53和PIK3CA突變與較短的無進展生存期（PFS）顯著相關，ctDNA分數較高的患者PFS較差。ctDNA中同源重組缺陷（HRD）相關基因突變檢出率高於匹配的腫瘤組織，並且這些突變往往與較短的PFS相關。所有7例患者均在治療結束時發現新的致病性變異，包括BRCA2，VHL，RAD50，RB1，BRIP1，ATM，FANCA和PIK3CA突變。總之，TP53和PIK3CA突變以及較高的ctDNA分數與曲妥珠單抗聯合細胞毒性化療的PFS較差有關。ctDNA中HRD相關基因突變的富集和新發現的變異可能與治療耐藥性有關。
研究背景
已知HER2陽性乳腺癌表現為HER2擴增，驅動癌細胞中的許多致癌過程。目前，已開發了多種抗HER2藥物，是HER2陽性轉移性乳腺癌（HER2+ MBC）的標準治療策略。通常推薦HER2雙靶向治療（曲妥珠單抗和帕妥珠單抗）聯合細胞毒性化療和抗HER2抗體-藥物偶聯物（ADC）[德曲妥珠單抗（T-Dxd）或恩美曲妥珠單抗（T-DM1）] 作為HER2+ MBC的一線或二線治療。對於後續用藥，基於繼續抗HER2治療的概念，推薦抗HER2酪氨酸激酶抑制劑、基因工程抗體或重新使用曲妥珠單抗聯合不同化療。
然而，關於抗HER2治療可以應用多少次，數據不足，沒有相關共識。在經過多線治療的患者中，預計積累了多種獲得性耐藥機制，治療壓力下的腫瘤克隆進化可能會改變原發性腫瘤細胞的基因組特徵。目前，關於經過多線治療的HER2+ MBC的分子變異的數據較少。識別與治療耐藥相關的分子變異，可以為這些人群帶來新的治療選擇。
基於組織的下一代測序（NGS）仍然是腫瘤基因檢測的金標準。然而，多次組織活檢的侵入性是一個主要障礙，特別是對於接受多線治療的患者。此外，腫瘤組織檢測在捕獲腫瘤內和腫瘤間異質性方面具有局限性，腫瘤異質性是治療耐藥的重要原因。基於血液循環腫瘤DNA（ctDNA）的液體活檢是一種有吸引力的替代方案，可以展現腫瘤的異質性面貌，以簡單安全的方式跟蹤基因動態變化。
在本研究中，我們使用參加KCSG BR18-14/KM10B試驗的患者的血液樣本，通過ctDNA分析，探索了經過多線治療的HER2+ MBC患者的累積基因變異及其臨床意義。
研究結果
ctDNA靶向測序結果
從93例患者中收集了100個外周血樣本。最終分析包括99個樣本的ctDNA數據，1個樣本未通過質控，被排除在外。總體而言，在篩查時獲得了92個樣本，並從7例患者中獲得了配對的治療結束時（EOT）樣本。1例患者在篩查期間未能提供血液樣本，僅收集了EOT樣本。在93例患者中，31例還提供了FFPE腫瘤組織。最終數據集包含的患者的臨床特徵如表1所示。
表1. 患者特徵
ctDNA突變譜和致病性變異發生率
生成了99個ctDNA樣本的突變譜，分析ctDNA致病性變異的發生率和相關性（圖1A）。去除胚系、黑名單和克隆性造血變異後，識別了65個基因336個致病性體細胞變異和25個拷貝數變異。TP53變異發生率最高（48/99個樣本），其次是PIK3CA（n = 21），ERBB3（n = 19），ATM（n = 17），RAD50（n = 16），ERBB2（n = 15），ARID1A（n = 12）和BRCA2（n = 11）。這與既往乳腺癌研究觀察到的特徵相似。
圖1. MBC ctDNA突變譜
對於合格樣本，計算ctDNA分數，評估其作為預後生物標誌物的效用。在99個血漿樣本中，85個計算了ctDNA分數，使用致病性變異的最高突變丰度，其餘14個樣本由於沒有致病性變異而被排除在分析之外。中位ctDNA分數為3.33%，其分布如圖1B所示。
ctDNA與匹配腫瘤組織基因變異的一致性
在同時具有血漿樣本和匹配腫瘤組織樣本的31例患者中，發現任一樣本135個基因存在體細胞變異。為了確定組織和血漿樣本的一致性，分析了CancerSCAN和Axen panel均覆蓋的61個基因。腫瘤和血漿樣本採集的中位時間間隔為42個月（範圍2-104個月）。16/31例患者兩個樣本有26個一致的變異，包括18個SNV，3個indel和5個擴增（圖2）。組織和ctDNA樣本的基因水平變異一致性從73.8%（45/61）到95.1%（58/61）不等，包括存在或不存在的所有變異。TP53（10/31，32.3%）的基因水平一致性最高，其次是PIK3CA（7/31，22.6%），範圍0%（0/31）到32.3%（10/31），與其他乳腺癌研究中報告的一致性相當。
圖2. 16例組織和血漿樣本有26個一致變異的患者前8個基因Oncoprint圖
進一步分析了可能影響一致性的幾個因素，例如腫瘤組織採集時間（原發性或轉移性組織）、組織和血漿樣本採集的時間間隔以及ctDNA分數。根據腫瘤組織採集的時間或組織與血漿採集的時間間隔，一致性沒有顯著差異。一致組（n = 16）的ctDNA分數顯著高於不一致組（n = 15）。這一結果提示，較高的ctDNA分數是影響血漿和組織一致性的主要因素，與先前研究報告的一致。
ctDNA中HRD相關基因突變的富集
發現HRD相關基因（包括ATM，RAD50，BRCA1/2，BRIP1，PALB2，BARD1和CHEK2）致病性變異在ctDNA分析數據中富集（圖1）。因此，探索了31對配對的腫瘤組織和ctDNA樣本中，HRD相關基因突變的檢出率是否不同。在ctDNA中檢測到的大多數變異AF低至<1%，然而，ctDNA中致病性變異的總數更高。其中，HRD相關基因突變在腫瘤樣本中占7.1%（2/28個致病性變異），在ctDNA樣本中占31.1%（51/164個致病性變異）（圖3）。
圖3. ctDNA中HRD相關基因突變的富集
根據ctDNA基因變異進行生存分析
對89例有生存信息的患者進行生存分析。中位隨訪時間為12.7個月（95% CI 10.3–15.1），所有89例患者的中位PFS和OS分別為4.6（95% CI 4.0–5.2）和19.7（95% CI 11.8–27.6）個月。如圖4所示，PIK3CA（中位2.9 vs 5.6個月，HR = 2.07，95% CI 1.17–3.68，p = 0.010）和TP53（中位3.3 vs 5.8個月，HR = 2.17，95% CI 1.35–3.47，p < 0.001）突變與較短的PFS顯著相關。較高的ctDNA分數（>3.33%[中位]）也與較差的PFS相關（中位3.3 vs 5.9個月，HR = 1.95，95% CI 1.25–3.05，p = 0.003）。PIK3CA突變、TP53突變和較高的ctDNA分數與較差的OS相關（分別為中位12.6 vs 22.9個月，p = 0.012；12.6 vs 19.7個月，p = 0.002；12.6 vs 22.9個月，p = 0.001）。TP53和PIK3CA突變以及ctDNA分數的預後價值在校正年齡（≤55歲vs >55歲）、既往抗HER2治療線數（≤3 vs >3）和內臟轉移的存在（否vs是）後仍保持一致。僅在15例患者中檢測到ERBB2擴增，ERBB2擴增患者的PFS較差（中位3.4 vs 4.9個月，HR = 2.11，95% CI 1.04–4.31，p = 0.034）。值得注意的是，HRD基因突變的患者往往PFS較短，儘管沒有統計學意義（中位3.2 vs 4.9個月，HR = 1.66，95% CI 0.91-3.03，p = 0.09）。
圖4. PFS和OS Kaplan-Meier曲線，根據 (a) ERBB2擴增，(b) PIK3CA突變，(c) TP53突變， (d) ctDNA分數分層
配對樣本分析發現治療後克隆進化
為了確定治療耐藥的潛在機制，分析了6例有配對ctDNA（初始和EOT）的患者的致病性變異（圖5）。這6例患者的PFS超過12個月，希望通過分析這些患者的樣本來確定獲得性耐藥機制。其中3例患者（S06287，S06793和S02397）也有腫瘤組織樣本。對於S06287，在腫瘤組織和初始ctDNA中均檢測到PIK3CA_E542K突變，在EOT樣本中未發現該突變，而是觀察到先前未檢測到的BRCA2和CDK12突變。在S04485中，最初未發現PIK3CA_E542K突變，但在EOT樣本中檢測到高AF的該突變。此外，除S02397外，EOT樣本均發現致病性HRD相關基因突變，包括BRCA2、RAD50、ATM、FANCA和BRIP1。
圖5. FFPE或連續ctDNA樣本致病性變異AF變化
討 論
HER2過表達是HER2+乳腺癌重要的致癌驅動因素和治療靶點，然而，已知其分子異質性是抗HER2治療的重要耐藥機制。此外，由於腫瘤的演變和治療壓力，轉移性乳腺癌的基因變異可能與原發腫瘤有很大不同，並且在多線治療後變得更加不同。本研究展示了多線標準抗HER2治療後疾病進展的HER2+ MBC患者的ctDNA基因突變譜。
與先前的研究一致，TP53和PIK3CA是突變發生率最高的兩個基因。已知TP53突變在HER2+乳腺癌中發生率特別高，TP53突變本身與早發性乳腺癌和預後不良有關。最近，Liu等人通過ctDNA分析，表明了TP53突變作為抗HER2療法（包括基於抗體的藥物和TKI）療效預測標誌物的潛力。在本研究中，TP53突變患者的PFS和OS較差。儘管由於單臂研究設計的局限性，無法證明TP53突變的預測作用，但對於預後較差的患者，開發靶向TP53突變的療法似乎是有必要的。PI3K異常激活也是乳腺癌（包括HER2+亞型）的致癌驅動因素，也是抗HER2治療的重要耐藥機制之一。先前的一項研究表明，攜帶PIK3CA激活突變的HER2+乳腺癌患者姑息性HER2靶向治療的病理完全緩解（pCR）率較低，PFS較短。在多種晚期癌症中，血漿ctDNA PIK3CA突變可以預測生存和治療結果，最近的一項薈萃分析在乳腺癌中證實了這一發現。本研究中，ctDNA檢出PIK3CA突變的患者治療反應較低，生存結果較差。此外，一例患者疾病進展時在ctDNA中檢測到高AF的PIK3CA致病性突變，提示該患者可能存在治療靶點。目前，許多使用PIK3CA抑制劑與抗HER2治療的臨床試驗正在進行中，這些研究有望為PIK3CA抑制劑在HER2 +乳腺癌中的作用提供信息。除了檢測單基因變異外，我們還計算了ctDNA分數，表明了其在HER2+ MBC中作為預後標誌物的潛在作用。有研究表明，ctDNA反映腫瘤負荷，可作為晚期癌症患者的預後和隨訪工具。幾項研究表明，在MBC患者中ctDNA分數可作為預後標誌物，最近一項研究提出，在真實世界中，在四種最常見的晚期癌症類型（包括 MBC）中，ctDNA分數作為實用、獨立的預後標誌物發揮作用。此外，雖然本研究沒有涉及，但幾項研究發現，早期治療中ctDNA動力學可預測治療結果。然而，在實際臨床實踐中應用ctDNA分數之前，需要解決許多問題，如panel靈敏度，計算ctDNA分數的標準公式以及可靠的閾值。
有趣的是，本研究發現，與腫瘤組織相比，ctDNA中HRD相關基因突變檢出率更高，並且HRD相關基因突變的患者往往具有較短的PFS。此外，疾病進展時收集的EOT樣本檢測到多個致病性HRD基因突變。有限的數據提示，在多個治療周期中，HRD相關基因變異累積。然而，考慮到HRD相關基因的功能，這種富集提示儘管先前的抗癌治療導致DNA修復機制受損，仍存在可以存活的腫瘤細胞。這些腫瘤細胞可能對後續治療耐藥。需要進一步的研究來確定是否可以進行相關靶向治療。
在本研究中，15例患者（16%）檢測到ERBB2（HER2）擴增，並通過微滴式數字PCR再次分析和確認。ctDNA HER2陽性率顯著低於先前研究報道的轉移性HER2+乳腺癌的33-96%和早期乳腺癌的9-31%。ctDNA ERBB2陽性率低可能歸因於先前的抗HER2治療效果。然而，在沒有確認相應腫瘤細胞中ERBB2擴增存在情況時，較難得出明確的結論。本研究揭示了ctDNA檢出ERBB2擴增與較差PFS之間的有趣關聯。假設ctDNA中低水平的ERBB2是由先前的抗HER2治療導致的，ctDNA中持續高水平ERBB2提示對抗HER2治療的潛在耐藥性。這一觀察結果與III期KATHERINE研究的結果一致，該研究中，含曲妥珠單抗的新輔助治療後殘留腫瘤HER2 RNA高表達與曲妥珠單抗輔助治療組的不良結局相關。此外，CALGB40601 研究顯示，在曲妥珠單抗±拉帕替尼等新輔助治療後存在殘留病灶的患者中，HER2富集亞型的無復發生存期較差。考慮到這些發現，ctDNA持續存在高水平ERBB2擴增或可作為抗HER2治療的潛在生物標誌物，值得在未來的研究中進一步驗證。本研究是作為與前瞻性臨床試驗平行的轉化研究進行的，但有一些局限性。首先，沒有同一時間點採集的腫瘤組織樣本可以與ctDNA分析結果進行比較。因此，無法確認ctDNA中新檢測到的變異，包括ERBB2擴增。其次，組織和血漿樣本採集的時間間隔較長。相對較低的一致性可能是由於長時間內發生了腫瘤進化，不過這需要進一步驗證。最後，我們沒有收集所有患者的連續隨訪ctDNA樣本。因此，無法獲得ctDNA動力學與治療效果相關性的數據。
總之，在HER2+ MBC患者中，TP53和PIK3CA突變以及較高的ctDNA分數與較差的PFS和OS有關。在ctDNA分析中注意到HRD相關基因突變的積累，其與較短的PFS有關。ctDNA分析可用於預測抗HER2治療療效和患者預後，即使在經過多線治療的人群中也是如此。還可以為這些患者提供有關新治療靶點的寶貴信息。
參考文獻：
Lee K, Lee J, Choi J, Sim SH, Kim JE, Kim MH, Park YH, Kim JH, Koh SJ, Park KH, Kang MJ, Ahn MS, Lee KE, Kim HJ, Ahn HK, Kim HJ, Park KU, Park IH. Genomic analysis of plasma circulating tumor DNA in patients with heavily pretreated HER2 + metastatic breast cancer. Sci Rep. 2023 Jun 19;13(1):9928. doi: 10.1038/s41598-023-35925-8. PMID: 37336919; PMCID: PMC10279711.