RAS突變可見於不同類型的甲狀腺腫瘤，需要更多的標誌物來更好地評估預後。本研究旨在評估在RAS突變甲狀腺癌，特別是分化型甲狀腺癌（DTC）中，其他關鍵基因突變的預後意義。分析了2014年1月至2021年12月期間在布萊根婦女醫院和/或丹娜法伯癌症研究院接受治療並進行了NGS檢測的連續的DTC、低分化甲狀腺癌（PDTC）或甲狀腺未分化癌（ATC）患者的臨床和基因特徵，納入了攜帶RAS突變的患者，基於是否存在其他致癌變異比較了臨床特徵和結局。納入了78例患者，其中22%（17/78）攜帶RAS驅動突變伴其他致癌變異。所有6例（100%）ATC均存在其他突變。與僅攜帶RAS突變的DTC相比，同時攜帶RAS和其他突變的DTC患者根據美國甲狀腺協會（ATA）復發風險分層評估系統被歸為復發風險高（77% vs 12%; P<0.001），原發性腫瘤較大（4.7 vs 2.5 cm; P=0.002）和診斷時為晚期（III或IV期）（67% vs 3%; P<0.001）的可能性更高。重要的是，平均隨訪65個月，如果同時攜帶其他突變，DTC特異性死亡率高出10倍以上（20% vs 1.8%，P=0.011）。本研究表明，在RAS突變DTC中，同時攜帶其他關鍵突變的甲狀腺癌更具侵襲性，死亡風險更高，並可以解釋RAS突變甲狀腺癌的多樣性。這些數據支持DTC進行基因檢測，為預後評估和臨床決策提供信息。
研究背景
甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，過去幾十年中，其發病率不斷上升。儘管大多數患者預後較好，但仍有一小部分患者表現為侵襲性疾病，復發風險較高，甚至最終死亡。
在過去十年中，我們對甲狀腺癌的基因特徵有了更多了解，特別是在具有里程碑意義的癌症基因組圖譜（TCGA）研究之後。研究表明，RAS癌基因（NRAS>HRAS>KRAS）在人類甲狀腺腫瘤的發生中起著重要作用，是繼BRAFV600E之後甲狀腺腫瘤中第二常見的變異。RAS基因突變導致MAPK通路組成性激活，是驅動甲狀腺癌轉化的起始事件，但其致癌潛力低於BRAFV600E變異。RAS突變可見於所有類型的濾泡起源的甲狀腺腫瘤，從濾泡腺瘤（20-25%），到甲狀腺癌，包括甲狀腺濾泡狀癌（FTC）和濾泡型甲狀腺乳頭狀癌（FVPTC）（30-45%），再到更具侵襲性的甲狀腺惡性腫瘤，包括低分化甲狀腺癌（PDTC）（20-40%）和甲狀腺未分化癌（ATC）（10-20%）。對RAS突變已經開展了廣泛研究，探索其診斷和預後作用。然而，由於上述異質性，目前其作為生物標誌物的潛在效用有限。
分析更具侵襲性的甲狀腺癌（如ATC和PDTC）的基因組和轉錄組學特徵，發現關鍵致癌變異的逐漸積累導致從惰性病變轉變為更具侵襲性的癌症。一個典型的例子是TERT啟動子突變，BRAFV600E和RAS突變PTC同時存在TERT啟動子突變與更差的臨床病理結果相關。我們最近的一項研究表明，PI3K通路突變與BRAFV600E突變PTC疾病特異性死亡率獨立相關。據我們所知，尚未有研究全面探索了RAS突變甲狀腺癌中其他致癌突變對預後的影響。
了解不同類型的RAS突變甲狀腺癌的特徵有助於臨床醫生進行個體化管理，無論是對於治療，還是為了更好的預後和個體化隨訪。本研究分析了NGS數據與臨床病理學特徵的相關性，以識別更具侵襲性、死亡風險更高的腫瘤。我們假設，異質性的RAS突變甲狀腺腫瘤初診時進行全面基因檢測有助於評估風險，以及為治療決策提供信息。
研究結果
RAS突變甲狀腺癌的基線特徵和基因特徵
患者和腫瘤特徵如表1所示。該隊列包括78例RAS突變甲狀腺癌患者（圖1）。65%為PTC（主要是FVPTC），13%為FTC，1%為Hurthle細胞癌或嗜酸性細胞癌（HCC），4%為PDTC，8%為ATC，9%被重新歸類為具有乳頭狀核特徵的非浸潤性甲狀腺濾泡性腫瘤（NIFTP）。平均年齡為52.3±15.3歲，63%（n=49）為女性。
圖1. 納入甲狀腺癌患者的流程，以及基於組織學類型和是否存在其他致癌突變的分類
所有RAS突變甲狀腺癌基因檢測結果顯示中位±四分位距（IQR）4±4個變異/腫瘤（範圍1-15）。重要的是，22%（17/78）的患者攜帶其他致癌突變。這些腫瘤的Oncoprint和選定突變列表如圖2A和表2所示。這些選定的其他突變是克隆事件，其次等位基因頻率（MAF）與RAS驅動突變相似（中位MAF分別為35%和32%，Mann-Whitney P = 0.9083 ns; 圖2B）。
圖2. 具有其他致癌突變的RAS突變甲狀腺癌的基因特徵。A. 具有其他致癌突變的RAS突變甲狀腺癌的Oncoprint檢測結果。B. RAS與其他致癌突變次等位基因頻率（MAF）的比較。選定的其他突變是克隆事件，其MAF與RAS驅動突變的相似（中位MAF：分別為35%和32%，Mann-Whitney P = 0.9083 ns）。
表2. 在17例RAS突變甲狀腺癌中發現的其他相關致癌突變
其他致癌突變在晚期甲狀腺癌中富集
所有RAS突變ATC患者（100%，6/6）均存在其他致癌突變，最常見的是TP53突變，有83%的患者檢出。正如預期的那樣，ATC患者的預後較差，死亡率為83%（5/6）。本研究審查時唯一存活的患者是唯一沒有TP53突變的患者（在診斷後96個月時存活）。從診斷起的中位生存期為18個月。5/6例ATC患者診斷時患有IVc期疾病，遠處轉移主要發生於肺部。
本研究隊列還包括3例低分化甲狀腺癌患者，其中2例僅存在RAS突變（即不存在其他選定的致癌變異），而剩下的1例攜帶NRAS加CDKN2A移碼突變。NRAS+CDKN2A突變患者在診斷後96個月死於甲狀腺癌，而2例僅RAS突變患者分別在診斷後156個月和25個月時存活。這2例患者中，一例患者臨床病程更具侵襲性，出現幾處遠處骨轉移，而另一例患者對治療反應較好，術後25個月未見疾病，這可能是在病程早期及時干預的結果。
其他致癌突變預測分化型甲狀腺癌死亡率
排除ATC或PDTC患者，分析69例DTC患者。59例DTC僅攜帶RAS突變，而10例同時攜帶RAS和其他致癌基因突變。具體的突變見圖2A和表2。
比較攜帶其他甲狀腺癌發生髮展相關基因突變的患者（RAS+其他突變組，N = 10）與僅攜帶RAS突變的患者（N = 59），發現兩組年齡和性別相似，前一組FTC比例更高（50% vs 8.5%，p = 0.002）。兩組的風險顯著不同（詳見表3），RAS+其他突變組原發性腫瘤較大（4.7±2.2 cm vs 2.5±1.8 cm，p=0.002），診斷時AJCC分期較高（III期或IV期）[67%（N=6）vs 3%（N=2），p<0.001]，根據ATA復發風險分層評估系統被歸為疾病復發風險高的腫瘤比例較高 [77%（N=7）vs 12%（N=7），p<0.001]（圖3A）。RAS+其他突變組中60%（n=6）的患者在診斷時有遠處轉移，而僅RAS組為8%（n=5）（p=0.002）。
表3. 僅攜帶RAS突變的DTC與攜帶RAS+其他致癌突變的DTC的臨床和病理特徵比較
圖3. 僅攜帶RAS突變的DTC與攜帶RAS+其他致癌突變的DTC之間的臨床病理特徵比較。A. ATA疾病復發風險的比較。B. 復發/持續性疾病發生率的比較。C. 比較僅RAS突變DTC與RAS+其他致癌突變DTC的疾病特異性死亡率的Kaplan Meier曲線。D. AJCC分期校正後比較僅RAS突變DTC與RAS+其他致癌突變DTC的疾病特異性死亡率的Kaplan Meier曲線
重要的是，RAS+其他突變組的患者疾病結局更差，與僅RAS組相比，復發或持續性疾病的發生率顯著更高（87.5% vs 11%，p<0.001）（圖3B）。攜帶突變的腫瘤更具侵襲性也體現在需要全身治療（56%（n = 5）vs 4%（n = 2），p<0.001）和外照射放療（56%（n = 5）vs 4%（n = 2），p<0.001）的患者比例更高。RAS+其他突變組的死亡率高出10倍（20% vs 1.8%）。僅RAS突變DTC患者的5年疾病特異性生存率為98%，而RAS+其他突變患者為70%（p = 0.007，圖3C）。ATA復發風險低的僅RAS突變患者無人出現復發，遠處轉移，或死於甲狀腺癌。
值得注意的是，在Cox回歸分析中，攜帶其他突變與疾病特異性死亡率相關（HR 12.27（1.11-135.43），p=0.041）。當納入AJCC晚期分期（≥3期）和性別時，其他突變仍然與疾病特異性死亡率獨立相關（HR 28.03（1.54-509.33），p=0.024）。圖3D展示了AJCC晚期分期調整後比較不同基因特徵的Kaplan Meier曲線。
最後，分析了在本研究DTC隊列中，在RAS突變FVPTC和PDTC中報告的染色體22q拷貝數缺失是否與更具侵略性的特徵有關。發現染色體22q拷貝數為2的DTC（N=44）與雜合性缺失的DTC（N=25）的臨床病理特徵無顯著差異。
討 論
在甲狀腺癌常規臨床實踐中，基因檢測得到越來越廣泛的應用，特別是對於晚期疾病，尋找靶向治療的患者。然而，結果解讀和數據轉化應用並不簡單。本研究全面分析了78例RAS突變甲狀腺癌患者的臨床病理學和基因組特徵。本研究中，ATC預後不良，且所有ATC都攜帶其他致癌突變。更重要的是，我們發現，即使在分化良好的RAS突變甲狀腺癌中，其他致癌突變也預測更具侵襲性的臨床病理行為，更具侵襲性的組織學特徵，更差的預後，復發/持續性疾病的發生率顯著更高，以及更高的疾病特異性死亡率。Cox回歸分析顯示，校正AJCC分期和性別後，基因特徵與死亡率有關。本研究數據強調了高度異質性的RAS突變DTC進行基因檢測的價值，可以輔助風險評估和治療決策。
RAS致癌突變導致下游MAPK和PI3K / AKT信號通路的組成性異常激活，這是甲狀腺腫瘤發生的關鍵事件。然而，與BRAFV600E相比，RAS突變對反饋抑制信號有反應，緩和MAPK活化程度。這導致RAS突變發生於不同類型的濾泡來源腫瘤。據推測，RAS突變濾泡腺瘤是RAS突變FTC和FVPTC的前體病變。儘管先前有研究表明RAS可能導致更具侵略性的表型，但最近一項研究並未發現RAS突變為疾病特異性死亡率的預測因子。因此，尚未證明RAS突變能夠可靠地判斷預後，需要其他標誌物將更具侵襲性的腫瘤在病程更早期階段識別出來。本研究表明RAS與其他選定基因變異共存可以作為侵襲性行為的有用生物標誌物。
本研究納入了大量RAS突變甲狀腺癌，深入分析了基因特徵與臨床病理學特徵的相關性。先前有研究顯示，在ATC中，存在RAS和其他關鍵致癌突變是預後不良因素，本研究結果與其一致。在RAS突變DTC中，之前對基因協同作用的了解僅限於DTC同時存在RAS和TERT啟動子突變與預後較差相關，而本研究數據將該概念擴展到RAS驅動DTC的其他致癌突變。我們使用Oncopanel NGS對數百個癌症相關基因進行了全面檢測，然後選出了與甲狀腺癌發生髮展和生物學相關的突變。雖然本研究隊列包含了不同類型的RAS突變甲狀腺癌，但中高風險甲狀腺癌較多，這些患者的臨床管理通常具有挑戰性。所以我們記錄了基因突變特徵未得到大量研究的腫瘤的遺傳事件。值得注意的是，2016年，有研究描述NIFTP主要為惰性腫瘤。雖然未來更大隊列研究專門探索這類腫瘤會很有趣，但我們沒有排除這類腫瘤，因為仍然存在診斷不確定性，當前的WHO分類沒有將其歸類為良性，在臨床實踐中，這些腫瘤的治療策略通常與非侵襲性FTC和FVPTC相同。
目前，臨床管理決策主要基於組織學分類和ATA疾病復發風險，其次基於對治療的反應。然而，對於疾病復發風險中等的腫瘤，治療和隨訪存在不確定性。這些腫瘤的基因檢測結果可以幫助更好地進行風險分層，攜帶RAS+其他致癌突變的中風險腫瘤可能歸類為高風險更好，支持傳統的病理評估與分子檢測相結合，為患者提供個體化治療。類似地，本研究表明，ATA復發風險低的僅RAS突變的腫瘤患者無人出現復發，遠處轉移，或死於甲狀腺癌。因此，本研究結果也有助於減輕該亞群患者和臨床醫生的隨訪負擔。
也有甲狀腺癌模型臨床前研究探索了其他致癌突變。在轉基因小鼠模型中，Hras（在牛甲狀腺球蛋白啟動子的控制下）和Kras（在高TSH刺激下）突變具有低致癌潛力，但可作為誘發因子。支持這一假設的是，體內研究表明，特定致癌突變可以促進RAS驅動的甲狀腺病變向侵襲性腫瘤發展，主要例子是致癌Ras伴p53缺失導致PDTC和ATC的發展。
對腫瘤進行全面基因檢測不僅可以更好地評估預後，還可以促進個體化腫瘤管理。在本研究隊列中，81%的RAS+其他致癌突變患者接受了某種形式的全身治療，如上所述，結局大多較差。因此，需要採用更有針對性的方案。儘管過去認為直接靶向RAS蛋白是不可能的，因為RAS蛋白表面缺乏藥物結合口袋，但最近已經採用了幾種策略，包括靶向上游和下游蛋白，直接RAS，以及RNA干擾。雖然最近已經開發了KRAS抑制劑，開展了臨床試驗，並獲得了FDA批准，但隨著耐藥性的出現，KRAS抑制劑單藥治療的長期獲益潛力不大，因此識別其他致癌突變對於聯合療法的選擇至關重要。靶向PI3K/AKT/mTOR通路的治療在臨床前模型中顯示出前景，但由於毒性，臨床應用大多失敗。儘管如此，晚期甲狀腺惡性腫瘤發現其他可靶向治療突變可以擴大治療選擇。
我們承認本研究存在局限性。本研究隊列規模相對不大，無法細分具有其他致癌突變的亞組時。然而，這是具有完整的基因和臨床病理學特徵的最大隊列之一，我們先前對BRAFV600E突變PTC進行了研究，本研究中各腫瘤亞型患者比例與該研究中相當。未來的多中心研究可以探索其他不同致癌突變的特定風險。儘管隨訪數據質量較高，但仍有10%的患者結局信息無法獲得。這兩個因素限制了本研究結果的統計功效，因此在較大患者隊列中驗證這些結果非常重要。此外，OncoPanel平台不包括EIF1AX基因。研究顯示，在一部分RAS突變甲狀腺癌中，EIF1AX突變與RAS突變共存，誘導去分化，因此有理由認為本研究隊列中的一些RAS突變腫瘤也攜帶EIF1AX突變。
總之，本研究數據展現了RAS突變甲狀腺癌最廣泛的臨床病理和基因特徵。本研究表明，RAS突變DTC同時存在其他致癌突變不僅與更具侵襲性的組織學表型有關，還與復發和死亡率增加有關。鑒於甲狀腺癌中僅RAS突變的診斷不確定性，我們認為全面基因檢測有助於更好地評估預後，指導治療和隨訪決策。我們承認臨床實踐中的成本和可及性問題，但這可以更好地為甲狀腺癌患者提供個體化治療。
參考文獻：
Bikas A, Ahmadi S, Pappa T, Marqusee E, Wong K, Nehs MA, Cho NL, Haase J, Doherty GM, Sehgal K, Barletta JA, Alexander EK, Landa I. Additional Oncogenic Alterations in RAS-Driven Differentiated Thyroid Cancers Associate with Worse Clinicopathologic Outcomes. Clin Cancer Res. 2023 May 16:CCR-23-0278. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-23-0278. Epub ahead of print. PMID: 37191996.