化膿鏈球菌Cas9（SpCas9）及其工程變體的靶向範圍在很大程度上限於含有G鹼基的原間隔物相鄰基序（PAM）序列。
2020年2月10日，博德研究所David Liu背靠背在Nature Biotechnology 在線發表題為「Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs」的研究論文，該研究報告了三種新的SpCas9變體的進化，它們使用噬菌體輔助的非連續進化共同識別了NRNH PAM（其中R是A或G，H是A，C或T），三種新的噬菌體輔助的DNA連續進化策略結合和DNA切割的第二選擇。這些進化的變體和SpCas9-NG的靶向能力在HEK293T細胞中進行了表征。進化的變體介導了人類細胞中插入缺失的形成和鹼基編輯，並且使鐮狀細胞貧血突變的A•T到G•C鹼基編輯能夠使以前無法編輯的CACC PAM進行。這些新進化的SpCas9變體與先前報道的變體一起，原則上可以靶向大多數NR PAM序列，並大大減少了基於Cas9的方法無法獲得的基因組位點的比例。
胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）使基因組DNA中的目標C•G到T•A轉換成為可能。最近的研究報道，原始的CBE BE3在小鼠胚胎和水稻中誘導低頻率的全基因組不依賴Cas9的脫靶C•G到T•A突變。2020年2月10日，博德研究所David Liu背靠背在Nature Biotechnology 在線發表題為「Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors」的研究論文，該研究開發了多種快速，經濟高效的方法來篩選不同CBE在大腸桿菌和人細胞中誘導Cas9獨立脫氨的傾向。該研究使用這些測定法來鑑定具有減少的與Cas9無關的脫氨基作用的CBE，並通過全基因組測序驗證YE1（縮小窗口的CBE變體）顯示背景水平的與Cas9無關的脫靶編輯。研究人員設計了YE1變異體，該變異體保留了高活性CBE的底物靶向範圍，同時保持了最少的與Cas9無關的脫靶編輯。在這項研究中表征和設計的CBE套件共同提供了約10-100倍的平均Cas9獨立性低脫靶DNA編輯，同時在規範CBE可以靶向的大多數位置上保持了穩健的正常編輯，因此特別適合應用在其中必須最小化脫靶編輯。
CBE是基因組編輯蛋白，由與催化受損的Cas9蛋白融合的胞苷脫氨酶和一個或多個尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白（UGI）組成。在由Cas9嚮導RNA置換的單鏈DNA環中，鹼基編輯活動窗口內的胞嘧啶脫氨 ，這部分內容已受到UGI的基本保護。相對DNA鏈的選擇性切口使細胞DNA修復偏向於取代未編輯的鏈，從而導致目標C•G鹼基對（bp）轉換為T•A鹼基對。CBE已在許多細胞類型和生物體（包括人類遺傳疾病的動物模型）中實現了高水平的單核苷酸多態性（SNP）轉換和低水平的indel缺失。
與其他Cas9指導的基因組編輯工具類似，鹼基編輯器可以綁定到與靶原間隔子具有高度序列同源性的脫靶基因組位點。這些依賴於Cas9的脫靶結合事件的一個子集可以導致鹼基編輯，可以通過使用具有更高DNA特異性的Cas9變體或通過將鹼基編輯器作為瞬時蛋白質-RNA復合物來實現。
最近報道說，原始CBE BE3在小鼠胚胎和水稻中過表達時，會誘導全基因組範圍內的隨機突變，平均頻率分別為5×10^-8 / bp和5.3×10^-7 / bp。這些偏離目標的編輯可能源自BE3脫氨酶域的內在DNA親和力，而與Cas9的指導RNA編程的DNA結合無關。Ye和他的同事隨後證明，CBEs還可以在人誘導的多能幹細胞中誘導不依賴於Cas9的脫靶突變。與Cas9依賴的脫靶編輯不同，Cas9依賴的脫氨作用發生在細胞之間的不同基因座上，從而難以通過靶向的高通量測序來表征。廣泛的全基因組測序（WGS）實驗低通量，昂貴且費時，限制了其用於評估和工程化Cas9獨立脫氨活性降低的CBE變異體。在這裡，研究人員描述了有效評估鹼基編輯器引起Cas9獨立脫氨的傾向的方法的發展，以及這些方法在鑑定和工程化最小化Cas9獨立DNA編輯的CBE變異體中的應用。
該研究開發了多種快速，經濟高效的方法來篩選不同CBE在大腸桿菌和人細胞中誘導Cas9獨立脫氨的傾向。該研究使用這些測定法來鑑定具有減少的與Cas9無關的脫氨基作用的CBE，並通過全基因組測序驗證YE1（縮小窗口的CBE變體）顯示背景水平的與Cas9無關的脫靶編輯。研究人員設計了YE1變異體，該變異體保留了高活性CBE的底物靶向範圍，同時保持了最少的與Cas9無關的脫靶編輯。在這項研究中表征和設計的CBE套件共同提供了約10-100倍的平均Cas9獨立性低脫靶DNA編輯，同時在規範CBE可以靶向的大多數位置上保持了穩健的正常編輯，因此特別適合應用在其中必須最小化脫靶編輯。
參考消息：
https://www.nature.com/articles/s41587-020-0414-6
https://www.nature.com/articles/s41587-020-0412-8