各類腎病接招！WES測序助力遺傳診斷率超1/3，一些人甚至改變臨床診斷和治療

表1

表2

基於WES的遺傳診斷：

172例患者均行WES檢測。根據ACMG指南，最小變異丰度＞5%的變異，以及可能是良性、良性和證據較少的非編碼變異被過濾掉，只選擇在符合每例患者表型的基因中發現的變異。陽性結果為致病性（P）和可能致病性（LP）變異。對於具有不確定意義的變異（VUS）患者，當家族成員檢測發現新生現象（de novo phenomenon）以常染色體顯性方式遺傳，或當家族成員檢測發現復合雜合以常染色體隱性方式遺傳，計算機模擬分析顯示明顯的功能惡化時，研究者認為結果為陽性。最初，WES在16例患者中發現了27個P變異，在47例患者中發現了55個LP變異，在46例患者中發現了55個VUS變異。除1個變異外，對所有這些變異進行的Sanger測序均獲得了相同的結果，隨後對80例患者進行了家族成員檢測。2個LP變異由於不匹配的遺傳模式、臨床表型和缺乏用於驗證的家族檢測而被排除。1例患者（表3中的患者14）攜帶兩個復合雜合變異，分別為P和VUS，根據ACMG規則，並在計算機分析、明顯的表型關係和家庭分析的支持下得到了確診。最後，63例患者的84個變異（包括27個P變異、56個LP變異和1個VUS變異）被認為是陽性結果（圖1），即在172例患者中，63例（36.6%）得到遺傳學診斷。在63例患者中，4例（表3中的第1、2、11和17例）已由作者描述。不同臨床表型的變異致病性分布見表2。

圖1

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表3

基於發病年齡和腎臟表型的WES診斷率：

從症狀出現到遺傳評估的中位間隔時間為2.8年（範圍0-28.4年）。在年齡<1歲（46.2%，18/39）、1-3歲（50.0%，7/14）和3-6歲（46.7%，7/15）的患者中診斷率較高，在6-12歲（35.2%，19/54）、8-40歲（28.6%，4/14）和12-18歲（28.0%，7/25）的患者中診斷率較低。在年齡≥40歲的患者中診斷率最低（9.1%，1/11）（p=0.232，圖2）。研究者還評估了腎臟表型和診斷率之間的關聯（表2和圖3）。腎小管間質疾病患者的診斷率最高（58.8%，20/34），其次是腎小球病（33.8%，25/74）、囊性疾病/纖毛病（33.3%，15/45）和CAKUT（18.2%，2/11），但這些差異無統計學意義（p＞0.05）。總體而言，80.9%（51/63）的診斷變異經通過Sanger測序進行的其他家族檢測證實，包括21例腎小球病患者、16例腎小管間質疾病患者、11例囊性疾病/纖毛病患者、2例CAKUT患者和1例病因不明ESKD患者（圖3）。

圖2

圖3

基於腎臟表型的基因變異譜：

各表型的基因譜見圖4。25例腎小球疾病患者共檢出10種單基因病，最常見的為COL4A5(48.0%，12/25)，其次為NUP107(12.0%，3/25)、INF2(8.0%，2/25)、WT1(8.0%，2/25)、COL4A3(4.0%，1/25)、COQ8(4.0%，1/25)、CUBN(4.0%，1/25)、MAF(4.0%，1/25)、NPHS1(4.0%，1/25)和PAX2(4.0%，1/25)。在20例腎小管間質疾病患者中共檢出18種單基因疾病，其中SLC12A3和UMOD變異各見於2例患者（11%）。該組的其餘患者在剩餘15個基因中各有1個不同的基因變異：ACE、AGXT、APRT、CDKN1C、CUBN、CYP24A1、GRHPR、HNF1B、HOGA1、HPRT1、KIF11、PHEX、SLC12A1、SLC22A12、SLC26A3和TRPM6。15例囊性病/纖毛病患者中共檢出10種單基因病。最常見的變異基因為PKD1(33.3%，5/15)，其次為PKHD1(13.3%，2/15)、BUB1B(6.7%，1/15)、CSPP1(6.7%，1/15)、NPHP3(6.7%，1/15)、LRP2(6.7%，1/15)、PAX2(6.7%，1/15)、PDHA1(6.7%，1/15)、TSC2(6.7%，1/15)和ZEB2(6.7%，1/15)。在2例CAKUT表型的ESKD患者中分別檢測到ZEB2和PAX2基因變異，NPHP3基因變異見於1例病因不明的ESKD患者。

圖4

遺傳診斷後GKD的重新分類：

在63例遺傳診斷的患者中，53例（84%）的臨床診斷與遺傳診斷一致，包括23例腎小球病、18例腎小管間質疾病、10例囊性/纖毛病和2例CAKUT。其餘10例根據遺傳學結果重新分類，包括1例從腎小球病重新分類為CAKUT（Pt1），1例從腎小球病重新分類為腎小管間質疾病（Pt4），2例從腎小管間質疾病重新分類為CAKUT（Pt5、Pt10），1例從囊性疾病/纖毛病重新分類為腎小管間質疾病（Pt6），以及1例從病因不明的ESKD重新分類為囊性疾病/纖毛病（Pt3）（表3）。其餘3例患者由囊性疾病/纖毛病重新分類為CAKUT（Pt 2、7、9），1例患者由囊性疾病/纖毛病重新分類為腎小管間質疾病或腎小球病（Pt 8）。6例患者（Pt 1- 6）可根據不同的表型分類進行診斷，4例疑似綜合徵性疾病患者（Pt 7-Pt 10）可明確綜合徵特徵的病因。

遺傳診斷對GKD管理的臨床影響：

遺傳診斷改變了63例遺傳診斷患者中10例（15.9%）患者的臨床管理（Pt 11-20，表3）。在5例復發性腎結石患者中，2例分別被診斷為PRT和HPRT1缺陷的患者（Pt 11和12）接受了黃嘌呤氧化酶抑制劑治療，以防止結石形成和腎功能不全進展。1例診斷為AGXT缺陷的患者（Pt 13）是lumasiran治療的候選患者，一種在腎移植後通過靶向乙醇酸氧化酶來減少肝草酸生成的RNA干擾劑。另2例（Pt 14和Pt 15）分別診斷為GRHPR缺陷和HOGA1缺陷的患者，給予枸櫞酸鉀治療。Pt 16的CUBN變異使其被診斷為慢性良性蛋白尿（OMIM 618884），從而避免了有創腎活檢或免疫抑制劑治療。Pt 17因TRPM6變異被診斷為腸道低鎂血症1型（OMIM 602014），開始補充鎂。在Pt 18、19和20中分別發現NUP107、NPHS1和COQ8B變異，使其停止免疫抑制劑治療，而在Pt 19中發現的COQ8B變異，表明需要補充輔酶Q10。

WES和管理的次要發現：

根據ACMG指南，2例患者出現了意外的次要發現。1例因PKD1基因變異疑似患有囊性腎病的女性患者也攜帶LP RYR1基因變異。根據ACMG指南和致病性評估，對該家系進行惡性高血壓的風險諮詢。1例因NUP107基因變異而患有腎小球疾病的男性患者同時攜帶LP MYH11基因變異，該變異遺傳自母親。該變異與發生動脈瘤或主動脈夾層或主動脈瓣病變（主動脈瘤，家族性胸椎4；OMIM 132900）。因此，建議該患者及其母親定期接受心功能評估。

染色體微陣列（CMA）分析的額外診斷：

14例患者行CMA分析，包括1例基於WES檢測疑似攜帶CNV，和13例合併多發先天畸形及發育遲緩。CMA分析顯示5例患者有5種診斷，3例患者為17q12缺失（包括HNF1β），包括1例腎鈣質沉著症、多發腎囊腫、低鎂血症和青少年的成人型糖尿病（MODY）患者， 2例為具有綜合徵疾病特徵和發育落後的先天性囊性腎病患者。此外，檢測到1例雙側腎臟發育不良伴皮質囊腫、面容異常、聽力下降的3月齡男童存在16q11q12微缺失，和在一名有鮮紅痣、單側多囊性腎發育不良、先天性心臟病、發育遲緩、畸形、白內障的7月齡女童中檢測到一個46,XX, der(21)t(6;21) (p25;q22.1)mat [20]/46, XX[50]基因型（表2）。

討 論

本研究評估了WES在兒童和成人各種類型腎臟疾病患者中的效用以及該方法的臨床適用性。本研究的結果是有意義的，因為描述了各種腎臟疾病的整體基因譜，並提示了根據年齡組和腎臟亞表型的不同的遺傳診斷率。本研究的總體診斷率為36.6%。相比之下，WES之前對病因不明的CKD或家族性腎病患者的診斷率為9.3%-60.0%，診斷率取決於患者的年齡、種族和近親比例，以及納入患者的數量和納入標準、臨床表型的定義/分類和代表性表型的同質性分級。本研究中WES對兒童GKD的診斷率與既往對兒童GKD的診斷率（36.2%-42.6%）相當。

在本研究的172例患者中，＜20歲患者有135例（78.5%），WES在該年齡段的診斷率最高（40.7%，55/135）。相比之下，成人的診斷率為29.7%（11/37）。最近的研究還表明，就診時年齡較小與較高的診斷率獨立相關，這表明早期進行基因檢測的重要性。在本研究中，從症狀出現到基因檢測的中位時間為2.8（0-28.4）年，需要進一步縮短這一間隔。雖然成年起病患者的總體診斷率略低，但遺傳診斷具有重要的臨床意義。如Pt 13，腎移植後腎結石反覆發作，腎功能不全進行性加重，遺傳診斷為APRT缺陷，提示需要降尿酸治療以防止進一步的腎損傷。

在患者人群存在的各種腎臟疾病中，WES對腎小管間質疾病的診斷率最高（58.8%）。在既往研究中，WES在該表型中也顯示出較高的診斷率（61.1%-100%）。這一高診斷率可能與這些患者的臨床和生化特徵相關，包括圍生期病史、生長遲緩和特異性電解質失衡伴酸鹼失衡。此外，本研究中82%的患者發病年齡為＜20歲。腎小球病和囊性病/纖毛病的診斷率為33%-34%，在有陽性家族史的患者中診斷率分別為提升至40.9%和50.0%。在本研究中，WES對主要包括激素耐藥型腎病綜合徵/FSGS和Alport綜合徵的腎小球疾病患者的診斷率與既往研究相當（7.2%-55.8%）。

常染色體顯性多囊腎病（ADPKD）是最常見的囊性疾病/纖毛病，主要通過直接測序法確診。由於重疊的同源區域和高GC含量使得該基因難以被WES捕獲，因此通過WES進行診斷受到了關注。但在疑似ADPKD患者中，使用定製探針進行WES的變異檢出率與直接測序相當，檢出率高達83.3%-99.0%。在一項研究中，WES對囊性腎病患者的總體診斷率為27%，其中＞90%的患者由於PKD1和PKD2的變異而患ADPKD。本研究未納入通過直接測序診斷為ADPKD的患者，在確診為囊性疾病/纖毛病的患者中，只有33%患ADPKD。因此，在這些囊性疾病/纖毛病患者中33.3%的診斷率應被認為與以往研究的診斷率相當或更高。

WES對先證者及其父母（三人）的診斷率高於既往研究中先證者單獨應用WES的診斷率（44.8% vs. 36.2%）。然而，在實際臨床實踐中，由於費用和可及性，僅先證者測序更常被選擇。本研究僅對先證者進行測序，隨後對家系成員的DNA進行Sanger測序，以確認先證者發現的變異的致病性。這些方法的診斷率相當。

本研究中各疾病組的總體基因譜與既往研究相似。腎小球病一般可分為兩個亞組，一組是遺傳性腎炎，48%的患者有COL4A5變異，4%有COL4A3變異；另一組為蛋白尿，36%的患者患有以NUP107、INF2、WT1、NPHS1和COQ8變異為特徵的單基因足細胞病。與之前的研究相似，本研究發現COL4A5變異是腎炎的主要病因。本研究中足細胞病的基因譜也與之前對WT1、NPHS1、NUP107、COQ6和COQ8變異導致的韓國激素抵抗型腎病綜合徵患者的研究結果一致。這一基因譜與白種人不同，白種人的變異發生率較高，尤其是在NPHS2、PLCE1、LAMB2和TRPC6中。其他研究也觀察到種族差異，這表明足細胞病在東亞人群中有獨特的基因譜，在中國、日本和韓國患者中，WT1、NPHS1、INF2和COQ8的變異發生率較高。

在本研究中，腎小管間質疾病表現出最不均勻的腎臟疾病分布。這些亞型包括與通道病相關的遺傳性腎小管病，主要是Gitleman或Bartter綜合徵；常染色體顯性遺傳腎小管間質疾病（ADTKD）譜，以UMOD為主；以及其他引起腎結石的原因。腎小管間質疾病的異質性在之前的隊列研究中也有報道，這些研究不僅包括CKD患者，還包括各種GKD表型的患者。例如，CLCN5、SLC12A3、SLC4A1、AGXT、OCRL、SLC12A1和ATP6V1B1在中國疑似腎小管疾病患兒中均有發現。對澳大利亞一個隊列進行的分析顯示，成人攜帶UMOD、FAN1、ATP6V1B1和CASR變異，兒童攜帶KCNJ1、CLCNKB、CLCN5、SLC12A3、CLDN16、SLC34A1和AVPR2變異。本研究中的囊性疾病/纖毛病的特徵主要是PKD1變異，然後是PKHD1變異，而不是既往關於成人囊性腎病的研究中報道的PKD2變異。超過70%有這一表型的患者年齡在20歲以下，80%的確診病例屬於這一年齡組。本研究參與者的年齡分布和臨床診斷為ADPKD的患者比例低可能部分解釋了疾病的分布，正如在其他納入兒童的研究中觀察到的那樣。分布於各個臨床表型組的表型包括腎小球病和囊性疾病/纖毛病中的PAX2變異，以及腎小管間質疾病中的HNF1β變異。

基於WES結果提示的一些疾病是出乎意料的，15.9%（10/63）的確診變異患者進行了疾病重新分類。同樣，在既往研究中，20-40%的患者在基因分析後需要重新分類。WES等基因分析後的這種相反表型分型對於遺傳病的診斷確認至關重要，並且可能有助於理解某一基因型的表型異質性。此外，遺傳診斷以及腎臟或腎外受累的確定，可使醫師根據每個基因型量身定製治療，從而提高患者的治療效果。如果沒有遺傳診斷，這種定製方案將是困難的。例如，在Pt 7檢出提示CAKUT的ZEB2變異，並伴有陰莖陰囊轉位和全面發育，因此進一步評估了該患者的心臟異常、聽力喪失和巨結腸引起的腸擴張，並計劃對腎功能和尿液分析進行評估，因為該患者可能表現為腎小球囊性疾病。

遺傳診斷可以使臨床醫生更好地了解疾病的病理生理和管理。準確的診斷可以改變患者的治療。例如，在Pt 17中發現TRPM6變異後，治療從補鈣改為補鎂，單基因足細胞病的發現提示應避免使用免疫抑制劑。準確診斷還可以提供新的治療選擇，以減緩疾病進展，例如，攜帶AGXT變異的Pt 13使用Lumasiran，攜帶COQ8變異的Pt 19使用COQ10。在63例遺傳確診的疾病患者中，研究者觀察到10例（15.9%）患者的臨床治療發生了變化。對於CAKUT或纖毛病患者，應進行腎外系統監測。在63例遺傳確診的患者中，7例(11%)攜帶COL4A5、NUP107、UMOD和NPHP3變異的患者接受了在世親屬供體選擇諮詢。最後，研究者與患者及其家庭成員討論了未來的生育計劃，以及建議進行指導監測的次要結果（RYR1、MYH11）。

由於結構變異（CNVs）可能是部分CAKUT疾病的病因，因此CMA可進一步在部分GKD患者中發揮補充診斷作用。在本研究納入的172例患者中，14例（8.1%）患者進行了CMA，診斷率為35.7%（5/14）。這5例患者中有3例存在17q12微缺失，而大約65%的基因病患者存在6個最常見的位點中的一個變異（1q12.1、4p16.1-16.3、16p11.2、16p13.11、17q12和22q11.2）。因此，對於疑似綜合徵性疾病伴有包括CAKUT在內的多種異常的病例，即使WES未檢出結構變異，也建議進行CMA檢查。

本研究有幾個局限性。WES本身在識別所有重要的遺傳變異方面有固有的局限性，包括存在於非編碼內含子/啟動子區域的變異、CNVs以及結構變異，包括數量可變的串聯重複序列、線粒體變異和覆蓋率低的外顯子。對於初次WES陰性的患者，應考慮追加CMA。由於進行了index-only WES，因此可能遺漏了一些變異，或者由於缺乏父母和未患病家系成員的數據，致病性評估受到影響。對於常染色體隱性遺傳基因變異的致病性，儘管存在復合雜合變異和一致的表型，但VUS的遺傳診斷仍存在爭議。雖然本研究納入的患者數量不少，但所有患者均為朝鮮族。因此，這些結果不能推廣到其他種族。

本研究結果證明了WES在各種腎臟疾病患者中的診斷效用和有效的臨床應用。測序成本的降低和分析技術的進步可能會增強WES在腎臟疾病患者診斷和管理中的臨床適用性。

參考文獻：

Jung, Jiwon et al. 「Genetic diagnosis of kidney disease by whole exome sequencing and its clinical application.」 Clinical genetics vol. 104,3 (2023): 298-312. doi:10.1111/cge.14382