低級別闌尾黏液性腫瘤有哪些分子特徵？和黏液性腺癌竟是同一疾病的不同階段？

3.WHO組織學分級：世界衛生組織（World Health Organization，WHO）將大部分非侵襲性的上皮源性腫瘤命名為低級別闌尾黏液腫瘤（low-grade appendiceal mucinous neoplasms，LAMNs），其本質是一類組織學上分化良好的腺瘤，但是卻能以惡性腫瘤的生長方式在闌尾外增殖，造成闌尾外黏液聚集。這些黏液可以以細胞結構形式存在或非細胞結構形式存在。這些闌尾腫瘤具有潛在惡性的生物學行為，例如會造成闌尾穿孔、闌尾壁的纖維化、闌尾壁黏液形成以及闌尾周圍軟組織內非細胞結構黏液聚集。高級別闌尾黏液腫瘤（high-grade appendiceal mucinous neoplasms，HAMNs）相比較LAMNs表現為具有更強侵襲性的細胞異型。

《中國闌尾腫瘤多學科綜合治療專家共識（2021版）》指出，闌尾腫瘤會導致闌尾穿孔和腹腔播散，當腹腔播散灶產生大量黏液時則被定義為腹膜假性黏液瘤（pseudomyxomaperitonei，PMP）。由於PMP在治療後容易復發且術後10年總生存期約為63%，因此專家組建議將PMP定義為一種惡性疾病。PMP黏液中細胞數目與患者的預後密切相關，因此專家組建議可以將其分為無細胞型、腹膜低級別黏液癌（low-grade mucinous carcinoma peritonei，DPAM）、腹膜高級別黏液癌（high-grade mucinous carcinoma peritonei，PMCA）、存在印戒細胞的腹膜高級別黏液癌（high-grade mucinous carcinoma peritonei with signet rings cells，PMCA-S）。共識詳情請移步往期推文：中國闌尾腫瘤多學科綜合治療專家共識（2021版）-附下載

雖然一些研究表明，PCI<20且術後無腫瘤（CC-0）的患者OS有所改善，但也有一些例外。例如，考慮到CRS後通常可以轉換為CC-0評分，高PCI對LAMN患者的意義較小。相反，低PCI並不意味著特定的組織學分級和手術部位的腫瘤細胞完全減少，例如上腹部黏液性印戒細胞癌。CC評分對外科醫生的價值也有限，因為在未進行CRS/HIPEC之前是不可用的。術前，外科醫生必須合理地預測腫瘤細胞完全減少的可能性，以避免使患者受到不必要的傷害。

AJCC/世界衛生組織播散性AMN的組織學分級已成為患者預後和管理的關鍵協變量。LAMN患者的中位 5 年OS率為 79-86%，而在黏液性印戒細胞癌患者中下降到 22-27% 。此外，組織學分級可以幫助對播散性AMN患者進行分層治療。在一項大型回顧性分析中，中度和低分化的黏液腺癌患者以及同時接受系統性輔助化療的患者與未接受系統性化療的患者相比，OS有所改善；然而，LAMN患者沒有觀察到對系統性化療的顯著獲益。儘管已經制定了一致的標準，但AMNs的組織學分級仍然是病理醫師困惑的源頭，也是一個存在重大分歧的領域。因此，需要客觀的生物標誌物來準確預測播散性AMN，並對患者進行分層以進行後續治療。

最近，對播散性AMNs的全面基因組分析已經確定了在不同組織學分級中普遍存在的基因變異。KRAS和/或GNAS的突變經常出現在LAMN和分化較差的黏液腺癌中。相比之下，TP53突變在LAMN中並不常見，但多見於分化程度較差的黏液腺癌中。然而，目前尚不清楚分子檢測是否有助於對伴有播散性疾病的AMN患者的臨床結果進行分層，因為大多數研究的患者數量有限。此外，考慮到這些腫瘤中的腫瘤細胞數量少，許多下一代測序（NGS）研究報告表示在播散性AMN患者中缺乏可檢測到的基因變異，這種情況較為常見。因此，本研究的目的是：（1）使用高覆蓋深度的獨特敏感靶向NGS測定大患者隊列，評估播散性AMN中基因變異流行率；（2） 將已鑑定的基因變異與各種臨床病理特徵相關聯，包括PCI、CC評分和組織學分級；（3）確定上述基因變異與其它預後因素的關係，以及臨床意義。

研究設計

研究人員回顧了匹茲堡大學醫學中心（UPMC）1998-2021 年間的外科病理學檔案，以尋找有可用HE染色切片和至少一個福馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和/或相應的未染色切片的播散性AMN患者（PMP）。如果唯一可用的組織石蠟塊來自原發性闌尾腫瘤，則該病例被排除在本研究之外。換句話說，基因檢測和分析僅限於播散性患者，不包含原發闌尾疾病的患者。此後，將病例與患者的電子病歷進行交叉引用，以確保有至少 6 個月的詳細臨床病史和OS數據。對於所有病例，至少由兩名病理學家對HE染色切片進行審查，以確定是否存在黏液性腫瘤，並排除其它實體瘤，如杯狀細胞腺癌。此外，任何單獨進行組織病理學會診的病例（不包括臨床/手術評估），都被排除在外。根據第 8 版AJCC分期手冊和 2019 年世衛組織消化系統腫瘤分類，對每個病例進行組織學分級。總共鑑定出 183 名患有播散性疾病的AMN患者。淋巴血管侵襲、神經侵襲和區域淋巴結轉移的存在是根據可用的病理切片，或從患者的病理報告中確認的。除了病理結果外，還從相應的臨床記錄和手術記錄中獲得了人口統計學數據（性別和年齡）、PCI和CC評分。

研究人員通過對手術FFPE標本進行靶向NGS檢測，以評估以下胃腸道癌症相關熱點基因突變狀態：AKT1、ALK、ATM、BRAF、CDKN2A、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53和VHL。研究人員根據 2017 年分子病理學協會/美國臨床腫瘤學會/美國病理學家學會（AMP/ASCO/CAP）制定的指南，對每種變異進行了排序。報告了I級、II級和III級變異，但只有I級和II級變異用於後續分析。該檢測方法的檢測極限為 3-5% 的變異等位基因頻率。檢測的最低覆蓋深度為1000×。

研究結果

播散性闌尾黏液性腫瘤（AMN）研究隊列

研究人群包含 183 名患者，年齡 27-87 歲（平均 58.1 歲；中位 57.0 歲），女性較多（103/183，56%）。根據AJCC和 2019 年WHO第 8 版標準，播散性AMN（PMP）組織學分級如下：82 例（45%）1級，66 例（36%）2級，35 例（19%）3級（圖1）。淋巴血管侵犯和周邊神經侵犯分別為 36 例（20%）和 22 例（12%）。此外，31 例（18%）患者被發現有局部淋巴結轉移。根據術中評價，PCI評分範圍在 1-39 之間（平均 22.2，中位 23.0）。對 183 例患者而言，進行手術目的是為了實現腫瘤細胞的完全減少；其中，167 例（91%）患者進行了CRS，157 例（86%）患者進行了HIPEC治療。CRS結束時，CC評分為：111 例（66%）CC-0，40 例（24%）CC-1，16 例（10%）CC-2。所有 183 例患者的隨訪時間為 3 個月至 23 年（平均 3.7 年，中位 2.8 年）。5 年的OS率為 77%，10 年OS率為 62%。

圖1 隊列中播散性AMN分類

A-C 腫瘤學分類1級，特點是豐富的黏液池，黏液上皮稀少，細胞核伴有輕度異常

D-F 腫瘤學分類2級，表現出破壞性侵襲，腫瘤細胞與粘蛋白比例升高，相關結締組織增生，細胞核異形程度更高

G-I 腫瘤學分類3級或分化程度較差的腺癌，由＞10%的印戒細胞組成

播散性AMN的靶向NGS檢測

圖2 183例播散性AMN患者及相關PCI、CC評分、AJCC/WHO分級和靶向NGS結果圖

靶向NGS檢出腫瘤細胞基因變異的患者有 179 例（98%）（圖2），腫瘤細胞含量為 10%-80%（中位 25%）。其中 13 個熱點突變頻率從高到低依次為：GNAS（59%）、TP53（24%）、SMAD4（19%）、PIK3CA（4%）、ATM（4%）、PTEN（2%）、NRAS（2%）、BRAF（2%）和CDKN2A（1%）。160 例（87%）患者存在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路突變，包括KRAS、NRAS和BRAF。此外，8 例（4%）GNAS突變的腫瘤未發生MAPK通路變異。總的來說，在 168 例（92%）播散性性腫瘤中發現MAPK/GNAS改變，這些基因變異與年輕的平均年齡、低AJCC/WHO分級、淋巴血管浸潤、神經周浸潤和區域淋巴結轉移相關（p< 0.030），如表1所示。相比之下，78 例（43%）患者的TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因（PIK3CA和PTEN）均發生了變異。如表2所示，這些基因的共突變（任何一種基因的改變）與較大的平均年齡、較高的AJCC/WHO分級、存在淋巴血管、神經周浸潤和區域淋巴結轉移，以及較低的平均PCI（p< 0.040）相關。另外，研究人員還對患者的CC評分進行了單獨分析，以確定CC-0/1和CC-2腫瘤患者之間的臨床病理和基因組差異。CC-2患者更有可能有更高的平均PCI評分，而接受HIPEC治療的可能性更低（p<0.001）。此外，mTOR基因（PIK3CA和PTEN）變異在CC-2腫瘤患者中更為常見（p=0.002）。

表1 183例播散性闌尾黏液性腫瘤（腹膜假性黏液瘤）的臨床和病理特徵：MAPK基因和/或GNAS的突變

表2 183例播散性闌尾黏液性腫瘤（腹膜假性黏液瘤）的臨床病理特徵：TP53、SMAD4、CDKN2A、ATM和mTOR基因變異

在一些研究中，AMN的組織學分級已獲證是一個預後因素。與先前的報告一致，隨著AJCC/WHO分級的增加，術後 3 年、6 年和 9 年的OS率呈縮短趨勢：AJCC/WHO組織學分類為1級患者的5年OS率為 93%，10年為 83% ；AJCC/WHO組織學分類為2級的患者5年OS率為 71%，10年為 17%；AJCC/WHO組織學分類為3級的患者5年OS率為 39%（p<0.001）（圖3A）。同樣，CC評分的增加對於OS率也具有統計學意義：CC-0的5年OS率為 88%，10年OS率為 70%；CC-1的5年OS率為 74%，10年OS率為 56%；CC-2的5年OS率為 61%，10年OS率為 46%（p<0.001)（圖3B）。在靶向NGS結果中，確定了KRAS、TP53、PTEN和CDKN2A的狀態與OS具有統計學意義的關係（p<0.006）。而TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和/或mTOR基因的狀態也是預後因素。沒有這些基因變異的5年和10年OS率均為 88%，存在這些基因變異的5年OS率為 55%，10年OS率為 14%（p＜0.001）（圖3C）。

圖3 播散性AMN患者OS的KM曲線

A AJCC/WHO組織學分級；B CC評分；C 有無基因變異

基於CC評分評估的OS率顯示，CC-0/1腫瘤患者在沒有MAPK/GNAS變異的情況下OS較差（p < 0.001）。相比之下，CC-2腫瘤患者在mTOR基因變異（PIK3CA和PTEN）的情況下，OS率較低（p = 0.002）。基於CC評分評估OS時，沒有其它基因變異與患者OS差異相關。

表3 183例播散性闌尾黏液性腫瘤（腹膜假性黏液性瘤）患者的總生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

表3 總結了與包括NGS結果在內的各種臨床病理特徵相關的單變量和多變量Cox回歸分析。在單變量分析中，較短的OS與年齡、較高的AJCC分級、淋巴血管浸潤、周圍神經浸潤、區域淋巴結轉移、較高的PCI、無法進行CRS、缺少HIPEC治療、通過CC評分評估殘留病灶的數量，以及TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和/或mTOR基因變異相關（p<0.016）。

此外，在包括AJCC/WHO分級、PCI、HIPEC治療、CC評分、TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因狀態的多變量模型中，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和/或mTOR基因變異是OS的獨立預後因素（p = 0.006）。

討 論

與之前的研究一致，播散性AMN（PMP）中最普遍的基因變異涉及MAPK信號通路和GNAS。MAPK/GNAS突變在 92% 的病例中存在，在所有三種AJCC/WHO組織學分級中均有發現。相比之下，在 43% 的播散性AMNs中發現了TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因變異，並優先在中度分化和分化較差的黏液腺癌中發現。此外，這些基因的突變在臨床上與患者OS降低有關，但OS降低與AJCC/WHO分級、PCI和CC評分無關。到目前為止，評估播散性AMN基因圖譜及其預後意義的報告數量有限。Ang等人的研究（最大闌尾腫瘤研究之一）與本文報道的結果類似，作者發現MAPK/GNAS突變是播散性AMN中最常見的基因變異，而TP53和SMAD4的失活在黏液腺癌和印戒細胞癌中被優先被檢測到。雖然進行預後隨訪的患者數量較少，但Ang等人的研究結果顯示TP53突變與患者OS的降低相關。同樣，Raghav等人發表的研究表示，TP53突變在中度分化和分化不良的黏液腺癌中富集，TP53突變狀態與CRS/HIPEC後較差的OS相關。然而，在調整AJCC/WHO分級後，TP53的突變並不是OS的獨立預後因素。值得注意的是，在Raghav等人的研究中，基因變異患者的患病率為 85% 。此外，MAPK基因和GNAS基因的突變率分別為 59% 和 28% 。相比之下，本文作者使用NGS Panel進行深度測序，發現 98% 的播散性AMN患者發生基因變異，分別有 87% 和 59% 的患者存在MAPK基因和GNAS突變，因此可以解釋先前研究和本文結果之間的差異。然而，Raghav等人假設，播散性AMN不是由單個優勢基因引起的，而是多個基因通路的失調引起的。這一假設得到了本文結論的支持，即不僅涉及TP53，還涉及SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因。

儘管在播散性AMN中存在基因異質性，但從靶向NGS的結果中可以推斷出一個潛在的腫瘤進展模型。基於胃腸道腫瘤通過累積基因變異併線性發展的原則，MAPK基因和/或GNAS的突變代表了播散性AMN中最早的基因事件，如前所述，在LAMN和黏液腺癌中均有檢測到。晚期基因變異特點包括TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因，主要在黏液腺癌中被發現。因此，本文數據表明，闌尾黏液性腺癌起源於LAMN。當考慮到其他具有類似基因變異的腫瘤，如由導管內乳頭狀黏液性腫瘤（IPMNs）引起的胰腺導管腺癌（PDACs）時，這種潛在的模型也有一定的根據。

除了LAMN，低級別發育不良的IPMN經常發生MAPK基因和GNAS突變，並獲得TP53、SMAD4、CDKN2A和mTOR基因變異，因為它們會過渡到高級別發育不良IPMN/PDAC，類似闌尾黏液腺癌。有趣的是，許多TP53和mTOR基因的獲得性變異獲證發生在高級別發育不良/PDAC之前。相比之下，LAMN中也存在TP53、SMAD4、ATM和mTOR基因的改變。對於患有低級別發育不良的LAMN和IPMN，在組織學上的低級別腫瘤中發現這些「晚期」突變表明腫瘤轉化的風險增加，可能需要密切的監測和/或更積極的管理。因此，本文的研究結果進一步強調了將靶向NGS納入評估播散性AMN的臨床效用。

研究作者表示該研究存在局限性。這是一項回顧性研究，並不是所有患者均接受了相同形式的HIPEC或系統性化療方案。此外，通過靶向NGS評估的基因數量相對較少。播散性AMN是具有豐富黏蛋白背景下的少細胞腫瘤，這對目前的NGS測序而言是一個重大的挑戰。本研究的另一個局限性是，研究人員評估了患者首次診斷為播散性疾病時的組織標本，因此在長期隨訪中，它不能充分評估多輪連續治療後播散性AMN的基因變化情況。最後，研究人員注意到一部分分化不良的黏液腺癌MAPK/GNAS突變陰性，這與提出的LAMN進展為黏液腺癌相反。然而，AJCC/WHO組織學分類3級的腫瘤病理評估面臨的挑戰之一是在分化不良的闌尾黏液腺癌和杯狀細胞腺癌之間進行鑑別。僅根據病理學評估，低分化闌尾黏液腺癌，如黏液印戒細胞癌，在組織學上可能與杯狀細胞腺癌難以區分。考慮到杯狀細胞腺癌中通常不存在MAPK/GNAS突變，因此，本研究中可能無意中納入了一小部分杯狀細胞腺癌，其類似於闌尾分化不良的黏液腺癌，從而解釋了這種差異。

結 論

總之，針對播散性AMN（PMP）的靶向NGS發現MAPK/GNAS具有較高的突變率，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因的突變頻率較低。然而，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和mTOR基因變異與黏液腺癌、淋巴管和神經束侵犯，以及患者較差的OS有關。此外，這些「晚期」突變是OS的不良預後因素，與AJCC/WHO分級、PCI和CC評分無關。雖然需要集中研究以進一步闡明播散性AMN的遺傳機制及其在初始治療後隨時間推移的腫瘤進展，但本文的分子研究結果表明，從LAMN到黏液腺癌的線性進展模式，其過渡特徵為多種基因通路的失調。

同刊專家點評

同刊的其他專家基於本文內容和相關領域研究進展，對本文進行了點評。雖然高級別闌尾癌的治療方法通常與結腸癌類似，但需要明確這兩種腫瘤是不同類型的實體瘤，它們具有不同的致癌驅動因素和體系突變頻譜。而且，在一些患者的腫瘤中發現高級別和低級別成分共存；一些重複進行細胞減滅術和腹腔熱灌注化療（CRS/HIPEC）的低級別患者，在最終病理檢查時也會發現低級別和高級別成分共存，這樣的情況較為常見。在同一患者不同病變的體外類器官培養研究中也觀察到了相似的異質性。

闌尾癌的基因圖譜

Wald等人（本文作者）展示了 183 名初診為低級別闌尾腫瘤患者的測序數據。他們的發現為上述臨床觀察提供了進一步的支持，表明低級別闌尾黏液性腫瘤（LAMN）和黏液性腺癌可能是同一疾病的不同階段，類似胰腺導管內乳頭狀黏液瘤（IPMN）進展為腺癌。

研究結果表明，在 183 例患者中，共有 179 例（98%）檢出了播散性AMN相關的基因變異。在與胃腸道惡性腫瘤有關的 28 個已知基因中，KRAS和GNAS突變最頻繁，並且具有突變共現（mutational co-occurrence）的趨勢，這一發現與先前的報道一致。也有觀察到其它基因發生重複突變，包括TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A、PIK3CA和PTEN，但頻率較低。

該研究作者根據他們的發現提出了一個遺傳進展模型。基於該模型，疾病進展的早期基因變異涉及絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）基因和/或GNAS的突變。這些突變在LAMN和黏液腺癌中均被檢測到。另一方面，晚期患者的基因變異特點是TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A和TOR基因突變，這些基因主要在黏液腺癌中觀察到。

GNAS或MAPK相關基因（KRAS、NRAS和BRAF）突變與發病年齡較小、組織學分級較低和侵襲水平降低顯著相關。與之相對的是，TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A、PIK3CA和PTEN體系突變與發病年齡較大、級別較高、淋巴結轉移和較低的平均腹膜癌指數（PCI）相關。

生存分析顯示，根據突變狀態，兩組患者的總生存率存在顯著差異。如果患者攜帶TP53、SMAD4、ATM、CDKN2A、PIK3CA和PTEN中的一個或多個突變（5 年生存率 55%），其生存期明顯短於沒有這些突變的患者（5 年生存率 88%）。重要的是，在平衡了組織學分級、腹膜癌指數（PCI）和細胞減滅術完整性（CC）評分後，多變量分析顯示這些突變仍是預後不良的重要預測因素，表明這些基因突變可能會影響晚期患者的生存率，對患者的治療具有一定的臨床意義。

Wald等人的研究結果與Foote等人最近發表的文章類似。同樣存在由TP53突變定義的與生存相關的黏液腺癌亞組。該亞組被作者稱為「TP53突變主導」（TP53-mutation predominant），與缺乏TP53和GNAS突變的臨床惰性「RAS突變主導」亞組相比，其總生存期明顯較差。作者還確定了黏液腺癌中「GNAS突變主導」亞組和「三陰性」亞組與不良的生存結果相關，並進一步證明了這些亞型在組織學為結腸型和杯狀細胞癌患者中的預後相關性。Wald等人研究發現，其隊列中只有 4% 的GNAS突變腫瘤缺少RAS（或BRAF）基因的共突變，可能因此掩蓋了GNAS和RAS突變主要亞型之間的生存差異。

作者表示還需要研究這些突變亞型與治療的相關性。例如，當檢出這些突變中的一種或多種時，是否會影響藥物敏感性或耐藥性？如果影響，該如何將這些信息納入治療選擇過程？

鑒於檢測成本的不斷下降，約三分之一的闌尾癌患者可以在不到 50 歲時確診，並且有 17% 的患者攜帶胚系致病基因。在這一現狀下，可否為所有闌尾癌患者提供泛用的體系和胚系變異檢測？或者是疑似致病變異的檢測？

在發生突變進化的復發性LAMN患者中，觀察多久是合適的？假設疾病殘留越多，發生影響結果的關鍵突變的機會就越大，這一結論符合邏輯嗎？這真的是文獻中描述的PCI對生存的影響嗎？此外，基因發生變異後多久會出現其表型效應？臨床該如何在患者治療中應用這些知識？

總之，目前缺少可識別的基因特徵來確定闌尾癌患者有無進行CRS/HIPEC手術的資格或預測治療療效，這強調了進一步研究以及與臨床工作相關的必要性。想在臨床環境中可有效用於闌尾癌的基因檢測，還需要取得更多進展。儘管如此，本文提及的研究工作意味朝著實現這一目標的方向邁出了有意義的一步。

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