針對實體腫瘤的免疫細胞治療面臨著系列挑戰，由於實體腫瘤自身的物理屏障，T 細胞等難以對其實現浸潤。
另一方面，實體腫瘤往往具有高度異質性，以往的技術手段（例如 CAR-T）只能殺傷部分實體腫瘤中的細胞，而逃逸的部分細胞可能會形成轉移病灶，因此治療效果十分有限。
實體腫瘤中包含了大量的血液細胞，其中，巨噬細胞（Macrophages） 在人體組織和實體腫瘤里分布廣泛，在某些瘤種中占浸潤血液細胞的比例可高達 40-50%，並在很多疾病或病理條件下發揮著重要的作用。
那麼，是否可以利用巨噬細胞，在實體腫瘤中作為新型細胞治療的藥物，讓它同時具備抗原依賴性和非抗原依賴性殺傷的特性呢？
圖丨Nature Immunology 當期封面（來源：Nature Immunology）
最近，浙江大學醫學院/良渚實驗室/浙江大學醫學院附屬第一醫院張進教授團隊通過系列研究，以巨噬細胞為切入點，從不同方面為解決針對實體腫瘤的免疫治療提供了新的解決方案。
研究人員開發出第二代抗原依賴性 M1 極化的 CAR-巨噬細胞（chimeric antigen receptor–macrophage，CAR-iMac），並證明巨噬細胞除了能夠以類似 CAR-T 的抗原依賴性方式進行靶向殺傷之外，還能夠在腫瘤細胞吞噬後，像樹突狀細胞（dendritic cell，DC）一樣，通過將腫瘤內部抗原提呈的方式刺激 T 細胞，從而讓 T 細胞接過「接力棒」，進一步對腫瘤細胞進行非抗原依賴性殺傷。
圖丨相關論文（來源：Nature Immunology）
近日，相關論文以《第二代 M1 極化的 CAR-巨噬細胞》（A second generation M1-polarized CAR macrophage with antitumor efficacy）為題，以封面論文形式發表在 Nature Immunology[1]。
論文共同第一作者為浙江大學醫學院博士後/助理研究員雷安華以及浙江大學博士後余華（現為南昌大學特聘教授)，通訊作者為浙江大學張進教授。
有望實現更好的實體腫瘤治療效果
那麼，二代的 CAR-iMac 與一代有何區別呢？第一代 CAR-iMac 設計的方法是 CAR 胞內只有一個促進殺傷的胞內結構域。類比第一代的 CAR-T，因 CAR 設計中僅有一個促進T細胞殺傷的胞內結構域，在臨床上療效並不理想。
第二代的 CAR-T 設計則增加了促進其持久性的 CD28 或 41BB 胞內結構域，在臨床上達到了優異的療效 。第二代 CAR-iMac 將促進巨噬細胞吞噬殺傷和促炎極化的兩個胞內結構域進行串聯，從而提供正交的雙重信號，有效地增強了 CAR-iMac 的抗腫瘤功能。
2020 年，張進課題組與美國賓夕法尼亞大學卡爾·朱恩（Carl June）課題組，分別用不同的手段開發了第一代巨噬細胞，當時兩個團隊的設計都是胞內只有刺激巨噬細胞吞噬殺傷的結構域。
其中，前者的細胞來源為誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），而後者的細胞來源是外周血單核細胞。
巨噬細胞獨特的特點之一，是需要變成 M1 型的促炎極化狀態，而該狀態可以促進從冷腫瘤微環境變成熱腫瘤微環境。
研究人員進行大量的篩選，最終發現將 TLR4 與 CD3 胞內結構域串聯到 CAR 之後，巨噬細胞同時具有吞噬殺傷和促炎極化兩方面的特點。
「我們在動物模型中驗證了其具有更好的療效，我們相信，在後續的臨床試驗中，很可能與 CAR-T 細胞的疊代發展類似，第二代展現出更好的治療效果。」張進表示。
圖丨第一代和第二代的巨噬細胞 CAR（來源：Nature Immunology）
第二代 CAR-iMac 設計有望助力科研人員設計相關臨床試驗，對其殺傷作用機制進行深入了解後，根據相關機制進行更加合理的臨床設計。
例如研究人員發現，CAR-iMac 是通過誘導腫瘤細胞凋亡，再吞噬凋亡碎片的方式，殺滅腫瘤細胞的。這一過程也被形象的成為「胞葬」作用 （efferocytosis）。
基於這一機制，通過設計與化療或放療的聯用，來誘導更多的凋亡碎片，有望實現更好的實體腫瘤治療效果。
圖丨第二代 CAR-iMAC 通過「胞葬」作用清除腫瘤細胞（來源：該團隊）
事實上，髓系樹突狀細胞（DC 細胞）藥物 Provenge 作為腫瘤疫苗，已經獲批 10 多年，但由於當時技術水平有限，並沒有對其進行任何有效的基因編輯。
而現在利用 iPSC 來源的巨噬/DC 細胞平台，基因編輯效率可達 90% 左右，能夠在對該細胞進行更好的工程化改造後，賦予其特異性及增強其他方面的功能。因此張進認為，該技術可能會對整個巨噬細胞免疫治療或 DC 細胞免疫治療的應用產生深遠的影響。
由於髓系細胞和巨噬細胞在人體各個組織中廣泛存在，因此當其被基因編輯後，作為一種工程化的細胞發揮治療作用的手段，有望被推廣和應用到涉及到巨噬細胞的（包括自身免疫病在內的）多種疾病中，為相關疾病提供新的治療思路。
幫助巨噬細胞躲過腫瘤細胞的「糖衣炮彈」
這些基因編輯的手段，除了用於直接在 CAR 上「做文章」以外，也可以用於對 iMac 的其他功能進行編輯，從而克服實體腫瘤治療中面臨的另一巨大挑戰：實體腫瘤中存在非常不利於免疫細胞發揮作用的微環境。
為解決該問題，研究人員提供了兩種解決方案。巨噬細胞與代謝密切相關，在腫瘤微環境中，其通常容易轉變為促進腫瘤發展的 M2 狀態。
他們 2023 年 10 月發表在 Nature Communications 的論文中[2]，通過 CRISPR 進行 3000 個代謝基因的遺傳篩選後，確定 ACOD1 是巨噬細胞促炎極化狀態的強調節因子。
當將該基因敲除後，不但巨噬細胞能夠變得像 M1 促炎極化的類型，還可以長時間對抗腫瘤細胞，而不變成 M2 類型。研究人員在小鼠模型中，觀察到 CAR-iMac 長達 2 周保持在 M1 的狀態，不會被免疫抑制的微環境逆轉。
（來源：Nature Communications）
此外，在腫瘤微環境中，很多腫瘤細胞的表面會發生糖基化，其與巨噬細胞上的受體會發生相互作用，進而通過抑制巨噬細胞功能將其「騙過」，也即腫瘤細胞的「不要吃我」信號。
在該課題組與浙江大學王本教授課題組 2023 年 10 月發表在 PNAS 的論文中[3]，研究人員發現，CAR-iMac 和能夠水解糖基化的唾液酸酶的聯合能夠明顯使 CAR-iMac 對抗實體瘤的能力增強。
（來源：PNAS）
研究人員還發現，在巨噬細胞接觸到腫瘤細胞後，Siglec-5和 Siglec-10 是被誘導出來最明顯的兩個糖基化的受體分子，介導了抑制巨噬細胞的作用。於是，他們通過基因編輯手段同時敲除這兩個分子，以幫助巨噬細胞不被腫瘤細胞的「糖衣炮彈」所影響。
未來布局巨噬細胞在體編輯系統
張進團隊的主要研究方向是將工程化幹細胞來源的免疫細胞用於免疫治療。多年來，在原始創新以及轉化應用方面開展了系統性的工作。
並且，他們還與賽元生物合作，共同建立了巨噬細胞 iMac（iPSC 來源的巨噬細胞）、eMAC（Edited MAC）、CAR-MAC、V-MAC 等主要研發與工藝技術平台。
提到 V-MAC，張進介紹道：「這是我們最近開發出來的一個基於脂質納米顆粒（Lipid Nanoparticle，LNP）-mRNA 遞送和在體巨噬/DC 細胞編輯的嶄新的平台。在體（in vivo）編輯技術與經典的體外（ex vivo）免疫細胞編輯進而回輸的方式比較起來，具有各自的優勢。」
值得關注的是，LNP 這種遞送載體，在沒有抗體修飾的情況下，絕大部分會天然的進入具有吞噬功能的髓系免疫細胞比如巨噬細胞和 DC 細胞，而不太會進入 T 細胞和自然殺傷細胞。
基於 LNP-mRNA 的新冠或者腫瘤疫苗，也正是通過進入 DC 細胞來發揮作用的。因此，髓系細胞是通過 LNP-mRNA 進行免疫細胞在體編輯的最佳對象。基於此，他們開發了這一技術平台 V-MAC 並將其應用於實體腫瘤等多種類型疾病的治療。
圖丨張進課題組（來源：張進）
未來，該團隊計劃「三步走」，即朝著「更深入、更聚焦、更開放」的方向繼續開展研究。第一，「更深入」，即利用 CAR-巨噬細胞相關技術平台的優勢來解決實體腫瘤的異質性的問題，以及促進微環境從冷腫瘤向熱腫瘤轉變。
「對於後者，我們現在已經有比較好的解決方案，前者還需要未來更多的深入的研究。」張進說。
第二，「更聚焦」。該課題組目前在臨床前的數據已經非常詳實，為臨床研究奠定了良好的基礎。他們的目標是充分結合巨噬細胞自身的特性，聚焦於 1-2 個臨床上缺乏治療藥物的實體腫瘤適應症，積極向臨床應用推進。
第三，「更開放」。目前，很多自身免疫疾病（例如系統性紅斑狼瘡）在臨床上也有巨大的未滿足的醫學需求，為此，他們開發了將巨噬細胞轉變為 M2 型抑炎巨噬細胞的新產品。
此外，在治療炎性疾病、纖維化、神經退行性疾病方面工程化巨噬細胞也大有用武之地，他們希望將已經建立的系統開放共享，通過與臨床、產業方面的專家合作，通過不斷的研究與轉化工作，為更多的患者帶來具有臨床受益並且安全的治療方案。
參考資料：
1.Lei, A.,Yu, H., et al.A second-generation M1-polarized CAR macrophage with antitumor efficacy. Nature Immunology (2023). https://www.nature.com/articles/s41590-023-01687-8
2.Wang, X., Su, S., Zhu, Y. et al. Metabolic Reprogramming via ACOD1 depletion enhances function of human induced pluripotent stem cell-derived CAR-macrophages in solid tumors. Nature Communications 14, 5778 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41470-9
3.Wu,J.,etal. Targeted glycan degradation potentiates cellular immunotherapy for solid tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 120 38，e2300366120(2023).
https://doi.org/10.1073/pnas.2300366120