Cancer Discov | 尿路上皮癌FGFR抑制劑耐藥機制及克服策略，迄今最大研究！

與其他癌基因驅動突變的疾病一樣，原發性和獲得性耐藥限制了FGFR抑制劑在尿路上皮癌中的療效。關於FGFR抑制劑耐藥機制的證據僅限於一項研究分析了22個英菲格拉替尼治療進展後的循環腫瘤DNA（ctDNA）樣本。在4例患者中發現獲得性FGFR3酪氨酸激酶結構域突變（FGFR3 V555L，V555M和L608V，根據NM_000142.4轉錄本）。

本文為FGFR驅動突變的尿路上皮癌患者選擇性FGFR抑制劑耐藥的分子和功能研究。FGFR酪氨酸激酶結構域突變和脫靶分子激活較常見。根據記錄的耐藥機制，使用臨床前模型評估了其他方案（其他FGFR抑制劑）和聯合治療策略，為未來臨床應用提供了潛在指導。

研究結果

晚期/轉移性尿路上皮癌的分子圖譜

收集了56例晚期/轉移性尿路上皮癌患者的臨床和分子數據（n = 39膀胱，n = 15上尿路，n = 2兩種位置均有）。38例患者對組織活檢樣本同時進行了全外顯子組測序（WES）和RNA測序（RNA-seq），9例僅進行WES，1例僅進行RNA-seq；8例患者使用靶向NGS panel對ctDNA和/或組織活檢樣本進行了檢測。

幾項開創性研究探索了尿路上皮癌，重點是局限性疾病中FGFR3變異的頻率和其他分子特徵。本研究對47例有腫瘤樣本WES數據的晚期/轉移性尿路上皮癌患者進行了全面的突變圖譜分析（圖1）。變異頻率最高的基因是TP53（51%），FGFR3（34%）和KMT2D（34%）。考慮到對腫瘤/間質成分存在差異的組織活檢樣本進行bulk RNA-seq分析評估表達譜的局限性，我們探索了39個有RNA-seq數據的樣本主要信號通路基因表達的差異。FGFR3驅動和非FGFR3驅動突變的患者樣本，除FGFR3 mRNA外，沒有明顯的特徵。具體分析FGFR家族成員表達水平，發現與FGFR3野生型（WT）樣本相比，FGFR3驅動突變的樣本FGFR3 mRNA強烈顯著過表達。相比之下，FGFR1和FGFR4 mRNA僅略低，FGFR2表達無差異。

圖1. MATCH-R或MOSCATO研究中進行了WES±RNA-seq的尿路上皮癌患者的突變圖譜

選擇性FGFR抑制劑治療進展的患者

然後，重點分析接受選擇性FGFR抑制劑治療的21例患者。12例為膀胱腫瘤，7例為上尿路腫瘤，另外2例兩種位置都有。11例攜帶FGFR3 S249C突變，5例FGFR3::TACC3融合，3例FGFR3 Y373C突變。1例患者（MR904）攜帶FGFR2::FAM83H-AS1重排，1例（MR103）攜帶FGFR4 D276N突變（圖2）。

圖2. FGFR抑制劑治療進展的尿路上皮癌患者詳情

收集厄達替尼（n = 14）、futibatinib（n = 4）或佩米替尼（n = 3）治療進展後樣本。1例患者的最佳反應為完全緩解（CR），12例部分緩解（PR），6例疾病穩定（SD），2例疾病進展（PD）。值得注意的是，所有患者之前都接受過晚期疾病治療，大多數患者接受FGFR抑制劑作為二線治療（範圍：二至六線），但無法證明患者在FGFR抑制劑之前接受的細胞毒性藥物類型與分子變異之間存在明確的相關性。

12例患者有進展後組織活檢和ctDNA樣本，6例僅有ctDNA樣本，3例僅有組織樣本。4例患者在厄達替尼或佩米替尼治療進展後接受了futibatinib治療。5例患者有額外的ctDNA樣本，可以進行縱向分析，其中1例患者厄達替尼和futibatinib治療進展後進行了組織分子檢測。分析了39個進展後樣本，包括16個組織和23個ctDNA樣本。

尿路上皮癌選擇性FGFR抑制劑治療進展後的分子特徵

• FGFR激酶結構域突變

在19例厄達替尼、佩米替尼或futibatinib治療進展的FGFR3驅動突變的尿路上皮癌患者中，7例患者檢測到FGFR3激酶結構域突變（37%；圖3A）。5/7例患者（71%）有治療前組織活檢和/或ctDNA樣本測序數據，在這些基線樣本中未檢測到FGFR3激酶結構域突變。值得注意的是，在所有進展後可及的ctDNA和組織樣本中檢測到FGFR3激活突變。6例患者ctDNA或組織活檢樣本檢測到單個FGFR3激酶結構域突變：N540K，V553L，V553M，V555L，V555M和E587Q（圖3A）。患者CTC1845在futibatinib治療前接受了厄達替尼治療（PR，67%；PFS，8.6個月），futibatinib治療進展後，ctDNA除了檢出Y373C激活突變外，還檢出3個FGFR3激酶結構域突變（N540K、V555L和L608V）（圖3A和B）。由於ctDNA擴增子大小的限制，無法評估這4個FGFR3突變的等位基因狀態（順式/反式構型）。

圖3. 尿路上皮癌FGFR抑制劑治療進展後檢測到的FGFR激酶結構域突變

患者MR410厄達替尼治療進展後，FGFR3 E587Q突變僅ctDNA檢出，TSC1 S561fs突變組織和液體活檢均檢出，FGFR3擴增和PIK3CA E726K突變僅組織活檢檢出（圖3B）。

在患者M322厄達替尼「基線」ctDNA樣本中，觀察到FGFR3::TACC3融合，進展後液體活檢中仍檢出該變異，變異丰度（VAF）更高，此外還檢出FGFR3 V555M突變和TSC2移碼突變（P28Lfs；圖3C）。

患者MR406經佩米替尼治療出現輕微的僅胸部進展，與胸內疾病患者ctDNA脫落有限一致，FGFR3 V553L突變僅在組織活檢中檢測到，未在ctDNA中檢測到（圖3D）。鑒於組織活檢中mRNA的可及性，進行了TOPO-TA克隆，在同一等位基因上觀察到FGFR3 S249C和V553L突變，證實了突變與驅動突變以順式關係發生。

患者MR560 FGFR3 S249C和V555L VAF增加反映了在厄達替尼治療期間的進展（圖3E）。

患者MR86厄達替尼治療前樣本檢出驅動突變FGFR3 S249C和PIK3CA E545K突變，組織活檢除了檢出這兩個突變外，還檢測到FGFR3 N540K突變（圖3F）。

此外，一例尿路上皮癌（MR904）患者檢測到FGFR2重排後，三線佩米替尼治療獲得CR（圖3G）。進展後（3年零4個月後），ctDNA分析顯示FGFR2融合（FGFR2::FAM83H-AS1）以及FGFR2 L551F突變（根據NM _022970.3轉錄本）。

• PI3K-mTOR通路基因變異

在19例FGFR3驅動突變的尿路上皮癌患者中，11例（58%）進展後和/或基線樣本檢測到PI3K-mTOR通路基因變異（表1）。

表1. FGFR3驅動突變的尿路上皮癌患者檢測到PI3K-mTOR通路基因突變

5個進展後樣本檢測到PIK3CA激活突變，但3例患者在FGFR抑制劑治療之前就存在PIK3CA變異（患者MR15，MR86和ST2267）。患者MR15和MR86使用厄達替尼後取得臨床緩解，隨後進展。患者MR86繼發FGFR3 N540K突變，EGFR過度磷酸化[由磷酸化受體酪氨酸激酶（RTK）陣列確定]可能解釋了患者MR15的耐藥性。相比之下，患者ST2267基線腫瘤檢出PIK3CA H1047R突變，對futibatinib原發耐藥。患者MR336在厄達替尼治療期間繼發PIK3CA E545K突變，可能是futibatinib耐藥的主要原因。

在FGFR抑制劑治療進展患者中，除PIK3CA突變外，TSC1/2失活突變（5/19）也有較常見（表1）。患者MR410在進展後（厄達替尼）組織和ctDNA中均檢測到TSC1 S561fs突變（VAF 69.96%），同時還檢測到PIK3CA E726K和FGFR3 E589Q（VAF 31.12%）突變。厄達替尼治療進展後，患者M322出現TSC2 P28Lfs突變，患者M521出現TSC1 Q865*突變，患者ST701出現TSC1 Q830*突變，患者MR1105在futibatinib進展後出現TSC1 A186fs突變。患者MR246患有FGFR3 S249C驅動突變的膀胱癌，最終厄達替尼治療進展，ctDNA檢測到NF2移碼突變和FGFR2 V517M突變。最後，一例對厄達替尼原發耐藥的患者（M2057）檢測到PTEN C136fs突變。

抑癌基因這些突變的發生率提示，其應被視為克服治療耐藥性的潛在靶標。

分子變異的功能分析和克服策略

• FGFR激酶結構域突變導致選擇性FGFR抑制劑耐藥

為了評估FGFR3激酶結構域突變對FGFR抑制劑活性的功能影響，我們生成了具有FGFR3::TACC3融合的Ba/F3細胞，攜帶N540K，V553L，V553M，V555L，V555M或L608V突變。細胞系間的FGFR3::TACC3外源融合蛋白表達水平是均勻的。將Ba/F3細胞暴露於劑量增加的FGFR抑制劑厄達替尼，英菲格拉替尼，佩米替尼，rogaratinib，futibatinib，derazantinib，AZD4547和zoligratinib，確定其相應的IC50值（圖4A）。LY2874455對親代Ba/F3細胞（無FGFR3::TACC3融合）的IC50為87.5 nmol/L，提示該藥物對增殖有脫靶效應。鑒於這一結果，以及LY2874455不再處於臨床開發階段，我們沒有將其納入藥理學實驗。

圖4. Ba/F3細胞模型中FGFR2/3激酶結構域突變的功能描述

8種選擇性FGFR抑制劑對FGFR3::TACC3 WT驅動的Ba/F3細胞系的IC50值在亞納摩爾/納摩爾範圍內。每個FGFR3激酶結構域突變使FGFR抑制劑的IC50值異質性增加。所有藥物對高頻N540K突變的IC50為>100 nmol/L，除了厄達替尼和futibatinib（低5倍）。同樣，厄達替尼和futibatinib對守門人V555L/V555M，V553M和L608V突變保持低活性。V553L突變似乎導致對FGFR抑制劑中等程度的耐藥性，因為五種抑制劑的IC50值接近10 nmol/L，但厄達替尼、英菲格拉替尼和futibatinib為亞納摩爾/納摩爾濃度。值得注意的是，一例使用佩米替尼的患者（MR406）出現該突變（圖3A和D）。

為了證實我們的觀察結果，在攜帶FGFR3::TACC3 WT或變異的Ba/F3細胞中，在肝素和酸性FGF（aFGF）刺激的情況下，使用濃度增加的厄達替尼濃度進行了免疫印跡分析。跨模型的細胞內信號分析證實了活力測定。在WT模型中使用低濃度的厄達替尼後，FGFR3、AKT和ERK磷酸化被消除，而N540K、V553M、V555L和L608V突變則需要更高劑量（圖4B）。V555M突變使用高劑量FGFR抑制劑，FGFR3磷酸化和細胞內信號傳導仍維持。我們證實，與佩米替尼相比，較低濃度的厄達替尼足以消除V553L突變的細胞內信號傳導（圖4C）。這支持在出現V553L突變的情況下使用厄達替尼進行有效序貫治療的假設，根據活力測定，英菲格拉替尼和futibatinib也是如此（圖4A）。

當攜帶FGFR3::TACC3 WT，FGFR3:: TACC3 N540K，FGFR3::TACC3 V555L的Ba/F3細胞暴露於30 nmol/L的厄達替尼，該抑制劑只能在WT模型中消除信號傳導（圖4D）。值得注意的是，在未經治療的情況下，兩個突變的信號傳導增加，在N540K突變基礎ERK磷酸化方面特別顯著，符合N540K突變的「分子制動」性質。

我們還旨在驗證FGFR2 L551F突變導致患者MR904對佩米替尼耐藥的作用，並尋找對該突變有效的其他藥物。我們生成了攜帶L551F突變的FGFR2::BICC1 Ba/F3細胞，將其暴露於八種FGFR抑制劑（圖4E和F）。除了證實L551F突變誘導佩米替尼耐藥外，我們的數據顯示厄達替尼和futibatinib可以克服該突變。

• 在攜帶PIK3CA激活突變的FGFR驅動突變的尿路上皮癌耐藥模型中，FGFR抑制劑聯合PIK3CA抑制劑具有協同作用

為了闡明PIK3CA E545K在FGFR抑制劑耐藥中的潛在作用，我們建立了患者衍生模型。在相應的MR86患者來源異種移植（PDX）模型中，厄達替尼和pictilisib（PI3K抑制劑）作為單藥或聯合使用，評估腫瘤生長。如圖5A所示，只有聯合治療可以有效抑制腫瘤生長，提示儘管一開始就存在PIK3CA突變的患者可能對治療有反應，但PIK3CA E545K突變促進致癌信號傳導，靶向該突變似乎與最大化腫瘤反應有關。

圖5. FGFR驅動突變的尿路上皮癌患者衍生模型中聯合治療的協同作用

• 使用患者衍生模型鑑定非突變耐藥機制

患者MR15患有FGFR3 S249C驅動突變的上尿路尿路上皮腫瘤。厄達替尼治療進展後，與基線樣本相比，組織活檢未發現額外的基因變異。建立了PDX和患者來源的細胞系。在確定在患者來源細胞系中八種FGFR抑制劑無法恢復敏感性後，我們進行了磷酸化RTK陣列，發現EGFR過度磷酸化（圖5B）。儘管厄達替尼和EGFR抑制劑吉非替尼作為單藥對細胞生長抑制沒有顯著作用，但聯合治療在MR15細胞系中顯示出協同作用（圖5C）。免疫印跡分析證實，需要雙重抑制來抑制細胞內信號傳導（圖5D）。體內藥理學研究證實了厄達替尼聯合吉非替尼（作為單藥活性低）對抑制MR15 PDX中腫瘤生長的協同作用（圖5E）。

討 論

FGFR抑制劑在FGFR驅動突變的膀胱癌中的陽性臨床數據首先為尿路上皮癌精準醫療提供了概念證明。然而，厄達替尼的ORR為40%，中位PFS為5.5個月，提示尿路上皮癌FGFR靶向治療領域仍有改善空間。在分子指導的治療中，了解FGFR抑制劑耐藥機制是開發新治療策略，改善患者總體反應和臨床益處的持久性的關鍵一步。

本研究識別了FGFR驅動突變的尿路上皮癌中FGFR抑制劑耐藥的在靶和脫靶機制。我們的數據來自組織活檢和ctDNA，具有互補性。如果ctDNA能夠捕獲腫瘤病灶間的分子異質性，組織活檢在低ctDNA脫落的情況下是有用的，特別是當疾病進展僅限於胸部，腫瘤負荷較低時。此外，組織活檢可以建立患者衍生模型，這是進一步了解耐藥和測試新療法和聯合療法的重要工具。本研究隊列中，5/21例患者（24%）無法確定耐藥機制。儘管由於FGFR抑制劑治療進展後多種分子檢測來源的可及性（血液，組織和患者衍生模型），這一「未知耐藥機制」比例較低，但當未發現可能導致耐藥的突變事件或當腫瘤微環境中的腫瘤細胞外因素導致耐藥時，系統地表征耐藥原因仍然具有挑戰性。

在本研究19例FGFR3驅動突變的尿路上皮癌患者中，7例（37%）在FGFR抑制劑治療進展後發現FGFR3激酶結構域突變。值得注意的是，耐藥時FGFR3激酶結構域的特徵與在FGFR2驅動突變的膽管癌中觀察到的特徵明顯不同。在膽管癌患者中，可逆性FGFR抑制劑治療進展後經常報告多克隆（即多個）FGFR2激酶結構域突變的發生。在本研究中，僅患者CTC1845檢測到多個FGFR3激酶結構域突變（N540K，V555L和L608V）。這例既往接受過厄達替尼治療的患者在futibatinib治療進展後只有ctDNA可及（缺乏組織活檢），無法連續評估突變，並且由於ctDNA擴增子大小的限制，無法確定等位基因狀態。Pal及其同事先前曾報道在4例厄達替尼治療進展的患者中檢測到V555L/M和L608V，但只有1例有多克隆表現（V555M和L608V）。除了這兩個突變外，我們還首次報道了選擇性抑制劑治療進展後其他FGFR3激酶結構域突變：N540K、V553L、V553M 和 E587Q。除後者外，所有其他突變事件均已在其對應的FGFR2位置（N550K，V563L，V565I/L/F，L618V，根據NM_001144913.1轉錄本）有報告，提示這些激酶結構域保守殘基也是FGFR3激酶結構域耐藥熱點。雖然本研究樣本量有限，很難得出特定突變的發生率，但守門人殘基FGFR3 V555和分子制動N540可能為開發新型抑制劑的相關靶點，鑒於其較高的頻率和耐藥模式。

雖然證實了FGFR3激酶結構域突變在導致對抑制劑耐藥方面的作用，但我們的功能研究在識別能夠克服在靶耐藥的藥物方面沒有提供信息。唯一的例外是佩米替尼治療後樣本繼發V553L突變，厄達替尼、英菲格拉替尼和futibatinib可能有效。值得注意的是，在可逆的FGFR抑制劑中，厄達替尼對FGFR3::TACC3 WT和突變的Ba/F3細胞系的IC50值均最低，這可能解釋了在臨床試驗中其療效更佳。

免疫印跡和細胞活力分析強調了分子制動（N540K）和守門人（V555L）突變對耐藥發生的不同作用。被認為會干擾藥物結合的V555L也促進細胞內信號傳導，主要表現為ERK磷酸化。後者在存在N540K時更顯著，符合N540殘基的「分子制動」功能。從這個角度來看，新型抑制劑需要具有更高的效力，應該能夠避免由守門人（和其他）突變引起的空間碰撞。

關於FGFR2 L551F突變的功能證據也表明，在FGFR2驅動突變的腫瘤中該突變或可靶向治療。本研究中患者MR904在佩米替尼治療進展後出現該突變，在Varghese等人的研究中，FGFR2驅動突變的膽管癌患者英菲格拉替尼治療進展後有類似的發現（另外一名患者在多克隆FGFR激酶結構域突變的情況下出現L551F）。FGFR2 L551F突變先前沒有描述過，本研究數據表明，L551F導致對佩米替尼和英菲格拉替尼耐藥，可以通過futibatinib和厄達替尼克服。

除了導致耐藥的在靶突變外，我們還識別了尿路上皮腫瘤中FGFR抑制劑耐藥時PI3K-mTOR通路高頻突變，伴或不伴有FGFR3激酶結構域突變。本研究和尿路上皮腫瘤分子圖譜研究顯示，在基線樣本中PIK3CA和TSC1/2變異與FGFR3不互斥。然而，其在進展後樣本中富集，強烈提示其參與耐藥。正如患者MR86衍生模型所示，基線PIK3CA激活突變可能不完全能夠導致耐藥，但可能代表改善反應的合適靶點。既往研究表明，本研究臨床樣本中觀察到的PI3K-mTOR通路變異在其他癌基因驅動突變的疾病中導致靶向治療進展，是特定抑制劑的合適靶點。

本研究有幾個局限。雖然是迄今為止關於該主題的最大研究，但有限的樣本人群使本研究結果不具有普遍性。儘管大多數患者治療前進行了測序分析，但不是所有患者。一些患者沒有匹配的進展後組織和ctDNA樣本，限制了我們可以獲得的分子信息的深度。儘管我們系統地嘗試建立患者衍生模型，但相對較低的成功率限制了非基因突變驅動的耐藥機制的識別。最後，我們沒有從功能上驗證TSC1/2突變的作用或其等位基因狀態。

總之，本研究首次系統探索了FGFR驅動突變的尿路上皮癌FGFR抑制劑耐藥機制。導致耐藥的在靶和脫靶分子證據有助於開發新治療策略，改善患者結局。

參考文獻：

Facchinetti F, Hollebecque A, Braye F, Vasseur D, Pradat Y, Bahleda R, Pobel C, Bigot L, Deas O, Florez Arango JD, Guaitoli G, Mizuta H, Combarel D, Tselikas L, Michiels S, Nikolaev SI, Scoazec JY, Ponce-Aix S, Besse B, Olaussen KA, Loriot Y, Friboulet L. Resistance to selective FGFR inhibitors in FGFR-driven urothelial cancer. Cancer Discov. 2023 Jun 28:CD-22-1441. doi: 10.1158/2159-8290.CD-22-1441. Epub ahead of print. PMID: 37377403.